Cyanine7.5 NHS，CY7.5活化酯，CAS号：786620-92-6
Cyanine7.5 NHS（CY7.5活化酯，CAS号：786620-92-6）是一种常用的近红外荧光标记试剂，由CY7.5荧光染料与NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）活化酯基团连接而成，核心作用是通过NHS活化酯与生物分子中的氨基（-NH2）发生共价反应，实现对蛋白、多肽、抗体、核酸等生物分子的荧光标记，广泛应用于免疫分析、细胞成像、药物筛选、分子生物学研究等领域。该试剂具有荧光穿透性强、标记效率高、生物相容性好等优势，CAS号786620-92-6可作为试剂纯度鉴定的核心依据，其荧光发射波长处于近红外区域，能有效减少生物样品的背景荧光干扰，提升检测灵敏度，适合用于复杂生物体系的标记与检测。
一、试剂基本特性
1. 化学信息：CAS号786620-92-6，分子式C45H52N4O6S2，分子量约813.05 Da，化学结构中CY7.5荧光母体为吲哚菁绿类衍生物，NHS活化酯基团通过酯键与荧光母体连接，具有较高的反应活性；2. 荧光特性：激发波长（Ex）约750-770nm，发射波长（Em）约780-820nm，荧光量子产率≥0.28，摩尔消光系数≥2.2×10^5 L·mol^-1·cm^-1，光稳定性良好，连续激发10小时荧光强度保留率≥85%，荧光信号稳定，不易淬灭；3. 反应特性：NHS活化酯基团可与生物分子中的伯氨基（-NH2）发生亲核取代反应，生成稳定的酰胺键，反应条件温和（室温、中性pH），无需催化剂，反应速率快，标记效率高（通常可达80%以上），且不与生物体内的羧基、羟基等其他活性基团发生非特异性反应；4. 溶解性：易溶于二甲基亚砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）等有机溶剂，难溶于水，在水溶液中易水解失效，因此需在无水条件下配制母液，使用时快速加入水相反应体系；5. 稳定性：在-20℃避光、干燥、密封条件下可保存12个月，4℃条件下可保存1-2个月，避免反复冻融和接触水分、强酸、强碱，否则会导致NHS活化酯水解，丧失反应活性，荧光染料也可能发生降解。
二、使用方法
1. 试剂准备：将Cyanine7.5 NHS试剂从-20℃冰箱取出，置于干燥器中室温避光解冻10-15分钟，避免试剂吸潮。根据实验需求，用无水DMSO或DMF配制成5-20 mM的母液，轻轻涡旋振荡至完全溶解，配制过程中避免引入水分（可使用无水试剂和干燥的离心管）。母液配制后立即分装为5-20 μL/管，密封后置于-20℃避光保存，反复冻融不超过3次，未使用完的母液需在24小时内用完。2. 反应体系配制：将待标记的生物分子（如蛋白、抗体、多肽）溶于合适的缓冲液中，推荐使用PBS缓冲液（pH 7.2-7.8）或Tris-HCl缓冲液（pH 7.0-7.5），生物分子浓度控制在0.5-2 mg/mL。根据生物分子的氨基数量，按照生物分子与Cyanine7.5 NHS的摩尔比1:5-1:15（常规比例为1:10），缓慢加入配制好的试剂母液，边加边轻轻搅拌，确保试剂均匀分散，避免局部浓度过高导致非特异性标记。3. 反应条件控制：反应体系置于室温、避光条件下孵育30-60分钟，若生物分子对温度敏感，可在4℃条件下孵育2-4小时，孵育过程中每隔15分钟轻轻搅拌一次，确保反应充分。4. 反应终止与产物纯化：反应结束后，加入过量的Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）或甘氨酸溶液（终浓度50 mM），孵育10分钟，终止反应（Tris和甘氨酸可与未反应的NHS活化酯结合，避免其继续反应）。随后通过凝胶过滤层析（如Sephadex G-25）、透析（透析袋截留分子量根据生物分子大小选择）或超滤等方法，去除未反应的游离Cyanine7.5 NHS试剂和反应副产物，纯化后的标记产物用PBS缓冲液透析平衡1-2小时。5. 标记产物验证与使用：纯化后的标记产物可通过荧光分光光度计检测荧光强度，计算标记效率（标记效率=（标记后荧光强度/标记前荧光强度）×100%），标记效率≥80%可用于后续实验。用于细胞成像时，将标记产物与细胞共孵育（浓度1-5 μM），孵育时间30-60分钟，PBS洗涤3次后进行成像；用于免疫分析时，可将标记产物作为荧光探针，与抗原/抗体结合后进行荧光检测。
三、注意事项
1. 防潮操作：NHS活化酯对水分极其敏感，易水解失效，因此试剂的储存、母液配制和使用过程中必须严格防潮，离心管、移液枪头需提前烘干，配制母液时使用无水有机溶剂，避免环境中的水分进入反应体系；2. 避光操作：CY7.5荧光染料对强光敏感，实验全程需在避光条件下进行，可使用铝箔包裹反应容器，检测时避免强光照射，防止荧光淬灭；3. 缓冲液选择：避免使用含氨基的缓冲液（如Tris-HCl缓冲液）配制待标记生物分子溶液，因为氨基会与NHS活化酯发生竞争反应，降低标记效率，若需使用Tris-HCl缓冲液，需在标记反应结束后再加入；4. 生物分子保护：待标记的生物分子需保持活性，避免在高温、强酸、强碱条件下处理，标记反应的pH控制在7.0-7.8，过高或过低都会影响反应效率和生物分子活性；5. 安全防护：试剂具有一定的刺激性和毒性，操作时需佩戴一次性手套、口罩和护目镜，避免皮肤接触、吸入和误食，若不慎接触皮肤，需立即用大量清水冲洗，必要时就医；6. 废弃物处理：实验产生的废液（含DMSO、未反应试剂等）、废管等废弃物，需按照化学危险品处理规范收集，集中处理，不可随意丢弃；7. 纯度验证：可通过高效液相色谱（HPLC）检测试剂纯度，以CAS号786620-92-6对应的标准品为参照，纯度≥95%方可用于实验，若纯度不足，会导致非特异性标记，影响实验结果。
四、补充说明
该试剂适用于各种含伯氨基的生物分子标记，标记后生成的酰胺键稳定，不会影响生物分子的结构和功能，可广泛应用于细胞成像、免疫荧光、Western Blot、流式细胞术等实验。若需用于水溶性较差的生物体系，可选择磺化修饰的Sulfo-Cyanine7.5 NHS，其水溶性更优，可直接溶于水相缓冲液，无需添加有机溶剂，降低对生物分子的毒性。此外，标记效率还与生物分子的浓度、反应时间、试剂用量等因素相关，实验过程中可通过优化反应条件，获得很优标记效果。
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