Cyanine7.5-DBCO，CY7.5二苯基环辛炔
Cyanine7.5-DBCO（CY7.5二苯基环辛炔）是一种新型近红外荧光标记试剂，核心由CY7.5荧光染料与DBCO（二苯基环辛炔）基团通过稳定的共价键连接构成，兼具CY7.5的近红外荧光特性与DBCO的无铜点击化学反应活性，广泛应用于生物医学研究、药物递送追踪、细胞成像、分子探针制备等领域。该试剂具有良好的水溶性、光稳定性和生物相容性，荧光发射波长集中在780-820nm区域，可有效避开生物样品自身的荧光干扰（ autofluorescence ），显著提升检测灵敏度和成像清晰度，尤其适合深层组织成像、活体动物成像等对荧光穿透性要求较高的实验场景。
一、试剂基本特性
1. 化学结构：CY7.5荧光母体为吲哚菁绿类衍生物，DBCO基团为亲脂性芳香环结构，两者通过亚甲基链连接，分子量约为750-800 Da（具体以实际检测为准）；2. 荧光特性：激发波长（Ex）约750-770nm，发射波长（Em）约780-820nm，荧光量子产率≥0.25，摩尔消光系数≥2.0×10^5 L·mol^-1·cm^-1，光稳定性优良，连续激发12小时荧光强度保留率≥80%；3. 反应特性：DBCO基团可与叠氮基团（N3）发生高效的无铜点击化学反应（SPAAC反应），反应条件温和（室温、中性pH），无需催化剂，反应速率快（二级速率常数约10^4-10^5 M^-1·s^-1），且不与生物体内的氨基、羧基等活性基团发生非特异性反应，特异性极强；4. 溶解性：易溶于二甲基亚砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）等有机溶剂，难溶于水，可通过添加少量助溶剂（如Tween-80）改善水溶性，适配生物体系实验；5. 稳定性：在4℃避光、干燥条件下可保存12个月以上，避免反复冻融（建议分装保存），避免接触强酸、强碱和氧化剂，否则会导致荧光淬灭或DBCO基团失效。
二、使用方法
1. 试剂准备：将Cyanine7.5-DBCO试剂从-20℃冰箱取出，室温避光解冻10-15分钟，根据实验需求，用无水DMSO或DMF配制成10-50 mM的母液，轻轻涡旋振荡至完全溶解，避免剧烈摇晃产生气泡（气泡会影响荧光检测准确性）。母液配制后可分装为10-50 μL/管，置于-20℃避光保存，反复冻融不超过3次。
2. 反应体系配制：以生物分子（如蛋白、多肽、抗体）标记为例，将待标记生物分子溶于PBS缓冲液（pH 7.2-7.4），浓度控制在0.1-1 mg/mL，按照生物分子与Cyanine7.5-DBCO的摩尔比1:3-1:10（具体比例根据生物分子的活性基团数量调整），缓慢加入配制好的试剂母液，边加边轻轻搅拌，确保试剂均匀分散在反应体系中。
3. 反应条件控制：反应体系置于室温、避光条件下孵育1-3小时，若需加快反应速率，可将孵育温度提升至37℃，孵育时间缩短至30-60分钟，避免温度过高导致生物分子变性。
4. 产物纯化：反应结束后，通过凝胶过滤层析（如Sephadex G-25）、透析或超滤等方法去除未反应的游离Cyanine7.5-DBCO试剂，纯化后的标记产物置于4℃避光保存，短期（1-2周）使用，长期保存需添加0.02%叠氮钠防腐，并置于-20℃避光条件。
5. 荧光检测与成像：纯化后的标记产物可通过荧光分光光度计检测荧光强度，验证标记效率；用于细胞成像时，将标记产物与细胞共孵育（孵育浓度根据细胞类型调整为1-10 μM），孵育时间30-60分钟，用PBS缓冲液洗涤3次，去除未结合的标记物，然后通过共聚焦显微镜（激发波长760nm，发射波长800nm）进行成像；用于活体成像时，通过尾静脉注射或局部注射方式将标记产物导入动物体内，注射剂量根据动物体重调整为5-20 nmol/只，注射后不同时间点（1-24小时）通过活体成像仪检测荧光信号分布。
三、注意事项
1. 避光操作：CY7.5荧光染料对强光敏感，整个实验过程（试剂配制、反应、纯化、检测）需在避光条件下进行，可使用铝箔包裹反应容器和离心管，避免荧光淬灭；2. 溶剂选择：试剂母液必须使用无水有机溶剂（DMSO或DMF）配制，若使用含水溶剂，会导致DBCO基团水解失效，影响反应效率；3. 反应pH控制：点击化学反应的最适pH为7.0-7.5，若反应体系pH过低（<6.0）或过高（>8.0），会降低反应速率，甚至导致反应无法进行，需提前调节缓冲液pH；4. 生物相容性：用于细胞实验或活体实验时，需确保试剂母液的有机溶剂终浓度不超过0.5%，否则会对细胞产生毒性或影响动物生理状态，可通过梯度稀释降低有机溶剂浓度；5. 安全防护：试剂具有一定的刺激性，操作时需佩戴一次性手套、口罩和护目镜，避免皮肤接触和吸入，若不慎接触皮肤，需立即用大量清水冲洗15分钟以上；6. 废弃物处理：实验过程中产生的废液、废管等废弃物，需按照化学危险品处理规范进行收集和处理，不可随意丢弃，避免污染环境；7. 标记效率验证：每次实验后，建议通过荧光分光光度计检测标记产物的荧光强度，计算标记效率（标记效率=（标记后荧光强度/标记前荧光强度）×100%），确保标记效果满足实验需求，若标记效率过低，可适当增加试剂用量或延长孵育时间。
四、补充说明
该试剂可与各种含叠氮基团的生物分子（如叠氮标记的蛋白、多肽、核酸、药物分子等）发生特异性点击反应，标记后不影响生物分子的活性和功能，适用于多种生物实验场景。若需用于水溶性较差的生物体系，可选择磺化修饰的Cyanine7.5-DBCO（Sulfo-Cyanine7.5-DBCO），其水溶性更优，可直接溶于水相缓冲液，无需添加助溶剂。此外，试剂的荧光强度受温度、pH、离子强度等因素影响，实验过程中需控制好反应条件，确保实验结果的重复性和准确性。
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