Cyanine3 carboxylic acid，CY3羧酸，CAS号：1361402-15-4
Cyanine3 carboxylic acid（CY3羧酸，CAS号：1361402-15-4）是一种常用的荧光标记试剂，核心结构由CY3荧光染料母体与羧基（-COOH）连接而成，CAS号1361402-15-4可作为试剂身份识别和纯度鉴定的关键依据。该试剂兼具CY3荧光染料的高亮度、良好光稳定性和羧基的反应活性，可通过羧基的活化反应（如与EDC、NHS联用），与生物分子中的氨基、羟基等活性基团发生共价连接，实现对蛋白、多肽、抗体、核酸等生物分子的荧光标记，广泛应用于细胞成像、免疫分析、分子杂交、药物递送追踪等生物医学研究领域。CY3羧酸的荧光发射波长处于可见光区域（550-570nm），荧光亮度高，易于检测，且生物相容性好，对细胞毒性低，是实验室常用的荧光标记工具之一。
一、试剂基本特性
1. 化学信息：CAS号1361402-15-4，分子式C32H37ClN2O2，分子量约517.11 Da，化学结构中CY3荧光母体为吲哚菁类衍生物，羧基位于荧光母体的末端，可通过活化反应实现与生物分子的连接；2. 荧光特性：激发波长（Ex）约540-550nm，发射波长（Em）约550-570nm，荧光量子产率≥0.65，摩尔消光系数≥1.5×10^5 L·mol^-1·cm^-1，荧光亮度高，是荧光素（FITC）的2-3倍，光稳定性优良，连续激发8小时荧光强度保留率≥90%，不易发生荧光淬灭；3. 反应特性：羧基本身反应活性较低，需通过EDC（1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺）和NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）共同活化，生成活性酯中间体，再与生物分子中的氨基（-NH2）发生亲核取代反应，生成稳定的酰胺键；也可与羟基（-OH）发生酯化反应，实现对含羟基生物分子的标记，反应条件温和（室温、中性pH），特异性强，不与生物体内的其他活性基团发生非特异性反应；4. 溶解性：易溶于二甲基亚砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）等有机溶剂，微溶于水，在水溶液中溶解度约为10-20 μM，可通过添加少量助溶剂（如Tween-20）或调节pH（至8.0-9.0）改善水溶性，适配水相反应体系；5. 稳定性：在-20℃避光、干燥、密封条件下可保存18个月，4℃条件下可保存3-6个月，避免反复冻融、接触强光和高温，避免与强酸、强碱、氧化剂接触，否则会导致荧光染料降解或羧基失效。
二、使用方法
1. 试剂准备：将CY3羧酸试剂从-20℃冰箱取出，置于干燥器中室温避光解冻10分钟，避免试剂吸潮。根据实验需求，用无水DMSO或DMF配制成10-50 mM的母液，轻轻涡旋振荡至完全溶解，配制过程中确保容器干燥，避免引入水分。母液配制后分装为10-50 μL/管，密封后置于-20℃避光保存，反复冻融不超过3次，未使用完的母液需在48小时内用完。2. 羧基活化：取适量CY3羧酸母液，加入到反应管中，按照CY3羧酸:EDC:NHS=1:1.2:1.5的摩尔比，加入EDC和NHS（均用无水DMSO配制），涡旋振荡均匀，室温避光孵育15-20分钟，使羧基充分活化，生成活性酯中间体。3. 生物分子标记：将待标记的生物分子（如蛋白、多肽、抗体）溶于PBS缓冲液（pH 7.2-7.8），浓度控制在0.1-1 mg/mL，缓慢加入活化后的CY3羧酸反应液，按照生物分子与CY3羧酸的摩尔比1:5-1:10，边加边轻轻搅拌，确保反应体系均匀。4. 反应条件控制：反应体系置于室温、避光条件下孵育1-2小时，若生物分子对温度敏感，可在4℃条件下孵育4-6小时，孵育过程中每隔20分钟轻轻搅拌一次，确保反应充分。5. 反应终止与产物纯化：反应结束后，加入过量的Tris-HCl缓冲液（pH 8.0），终浓度为50 mM，孵育10分钟，终止反应，中和未反应的活性酯。随后通过凝胶过滤层析（Sephadex G-25）、透析或超滤等方法，去除未反应的CY3羧酸、EDC、NHS及其反应副产物，纯化后的标记产物用PBS缓冲液透析平衡1小时。6. 标记产物验证与使用：通过荧光分光光度计检测标记产物的荧光强度，计算标记效率（标记效率=（标记后荧光强度/标记前荧光强度）×100%），标记效率≥75%可用于后续实验。用于细胞成像时，将标记产物与细胞共孵育（浓度5-10 μM），孵育时间30分钟，PBS洗涤3次后，通过荧光显微镜（激发波长546nm，发射波长565nm）进行成像；用于免疫分析时，可将标记产物作为荧光探针，与抗原/抗体结合后进行荧光检测。
三、注意事项
1. 活化反应控制：羧基活化过程中，EDC和NHS的用量需严格按照摩尔比添加，过量的EDC或NHS会导致非特异性标记，影响实验结果；活化时间不宜过长（不超过20分钟），否则会导致活性酯水解失效；2. 避光操作：CY3荧光染料对强光敏感，实验全程需在避光条件下进行，可使用铝箔包裹反应容器和离心管，检测时避免强光照射，防止荧光淬灭；3. 缓冲液选择：标记反应的最适pH为7.2-7.8，避免使用含氨基的缓冲液（如Tris-HCl）配制待标记生物分子溶液，以免氨基与活性酯发生竞争反应，降低标记效率；若需使用Tris-HCl缓冲液，需在反应终止后加入；4. 水溶性调节：若反应体系水溶性较差，可添加少量Tween-20（终浓度0.1%-0.5%）或调节pH至8.0-9.0，改善CY3羧酸的溶解性，但需注意助溶剂浓度不宜过高，避免对生物分子活性产生影响；5. 安全防护：试剂具有一定的刺激性，操作时需佩戴一次性手套、口罩和护目镜，避免皮肤接触、吸入和误食，若不慎接触皮肤，需立即用大量清水冲洗，必要时就医；6. 废弃物处理：实验产生的废液（含DMSO、EDC、NHS等）、废管等废弃物，需按照化学危险品处理规范收集，集中处理，不可随意丢弃；7. 纯度验证：可通过高效液相色谱（HPLC）检测试剂纯度，以CAS号1361402-15-4对应的标准品为参照，纯度≥95%方可用于实验，纯度不足会导致荧光信号异常和非特异性标记。
四、补充说明
该试剂可灵活用于各种生物分子的标记，通过羧基活化反应，可实现与氨基、羟基等不同活性基团的连接，适配多种实验场景。若需用于水溶性要求较高的实验（如活体成像、水溶液中的分子检测），可选择磺化修饰的Sulfo-Cyanine3 carboxylic acid，其水溶性显著提升，可直接溶于水相缓冲液，无需添加有机溶剂，降低对生物体系的干扰。此外，标记效率还与生物分子的浓度、反应时间、活化条件等因素相关，实验过程中可通过优化这些条件，获得很优的标记效果。同时，CY3羧酸的荧光信号可与其他荧光染料（如FITC、CY5）形成荧光共振能量转移（FRET）对，可用于双标或多标实验，拓展实验应用范围。
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