CY3-NHS，CY3标记活性酯
CY3-NHS（CY3标记活性酯）是一种经典的可见光区荧光标记试剂，隶属于花菁染料家族，核心用途是实现生物分子的特异性荧光标记，广泛应用于生物医学、分子生物学等科研领域，是荧光成像、蛋白示踪、核酸检测等实验的核心工具之一。其化学全称为Cyanine3-N-Hydroxysuccinimide Ester，CAS号为1032678-38-8，分子式为C₃₄H₄₀ClN₃O₄，分子量为590.16，外观呈现红色固体状，具备典型的花菁染料光学特性。
从化学结构来看，CY3-NHS主要由两部分构成：一是CY3荧光染料核心，拥有共轭多烯链结构，这是其荧光特性的来源，能够吸收特定波长的可见光并发射明亮的橙红色荧光；二是NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）活性酯基团，作为反应活性位点，负责与目标生物分子发生共价结合。其中，NHS活性酯的作用是活化CY3分子中的羧基，使其能够高效与生物分子上的伯氨基（主要来自赖氨酸侧链）发生酰胺化反应，形成稳定的酰胺键，从而将CY3荧光基团牢固连接到目标分子上，标记过程温和且特异性强。
理化特性方面，CY3-NHS的光谱性能优良，在PBS缓冲液中，激发波长（Ex）约为554nm，发射波长（Em）约为566nm，处于肉眼敏感的可见光区，且荧光亮度高、消光系数达150000L·mol⁻¹·cm⁻¹，量子产率为0.31，光稳定性优于荧光素类染料，不易发生光漂白，适合长时间连续观测。溶解性上，该试剂易溶于甲醇、DMF、DMSO等有机溶剂，微溶于水，因此在水相标记反应体系中，通常需要加入少量有机共溶剂辅助溶解；若目标分子对有机溶剂敏感，可选择其磺化衍生物Sulfo-CY3-NHS，二者光谱性质一致，可相互替换。此外，CY3-NHS对pH值不敏感，在较宽的pH范围内能保持稳定的荧光性能，但对湿气敏感，含水条件下会缓慢水解为羧酸，丧失标记活性。
制备方法上，CY3-NHS通常采用两步法合成：首先通过化学反应合成CY3-COOH（CY3羧基衍生物），再利用NHS与CY3-COOH在脱水剂（如DCC）作用下发生缩合反应，生成CY3-NHS活性酯。合成过程中需严格控制反应温度和湿度，避免活性酯水解，产物经柱层析纯化后，纯度可达到95%以上，满足科研实验的高纯度要求。使用时，需提前将CY3-NHS用无水DMF或DMSO配制成母液（推荐浓度10mg/mL），反应体系pH控制在8.5左右（微碱性条件下活性高），避免使用Tris、甘氨酸等含伯氨基的缓冲盐，防止其与活性酯反应导致试剂失活。
应用领域十分广泛，核心集中在生物分子标记与成像：在蛋白质标记中，可用于抗体、酶、抗原等蛋白的荧光修饰，实现蛋白定位、分子相互作用、蛋白表达量检测等研究；在核酸标记中，可与氨基修饰的DNA、RNA反应，用于核酸杂交、基因定位、核酸转运示踪等实验；在细胞生物学中，标记后的生物分子可用于活细胞成像，追踪细胞内生物过程的动态变化；此外，还可用于荧光免疫分析、流式细胞术、生物传感器制备等领域。保存条件上，需在-20℃、避光、干燥环境下密封保存，从冰箱取出后需平衡至室温再开盖，母液配制后应在24小时内使用，避免水解失效。
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