ICG-TCO，吲哚菁绿-反式环辛烯这种新型近红外荧光试剂
ICG-TCO是吲哚菁绿（ICG）修饰反式环辛烯（TCO）后的新型近红外荧光试剂，分子量约为923.2 Da，外观为深绿色粉末，兼具ICG的生物相容性、近红外荧光性能与TCO的生物正交反应活性，属于无铜点击化学试剂，相较于含铜催化的叠氮-炔基反应体系，更适合对铜离子敏感的生物体系（如活细胞、活体组织）的标记。
理化性质方面，ICG-TCO的光学性能与ICG相近，激发波长约为778-782 nm，发射波长约为798-802 nm，摩尔消光系数高，荧光量子产率优异，在近红外光区域具有强穿透力和低背景干扰的优势，可满足深层组织成像和活体检测需求。溶解性方面，其在DMSO、DMF等极性有机溶剂中溶解性良好，在水中溶解度较低，配制储备液时需以有机溶剂为溶剂，稀释至工作浓度时可选用生理盐水、PBS缓冲液等生物相容性溶剂，稀释过程中需轻柔混匀，防止出现团聚现象。光稳定性方面，ICG-TCO在避光条件下稳定性较好，相较于ICG-N3，其抗光漂白能力略有提升，但在强光照射下仍需注意控制时间，避免荧光信号衰减。此外，该试剂在生理pH范围（7.0-7.8）内性能稳定，不会发生明显的荧光淬灭或结构降解，适合生物体内的标记反应。
作用机制基于逆电子需求狄尔斯-阿尔德（IEDDA）反应和近红外荧光发射原理。TCO作为亲双烯体，可与含四嗪（Tetrazine）基团的目标分子发生高度特异性的IEDDA反应，该反应无需金属催化剂，反应速率快（二级反应速率常数可达10⁶ M⁻¹s⁻¹），反应条件温和（常温、生理pH），副产物仅为氮气，无毒性，不会对生物体系造成干扰。ICG基团则作为荧光报告基团，在近红外激发光照射下释放荧光信号，通过检测设备捕获信号，实现对目标分子的定位、追踪及定量分析。这种无铜点击反应体系有效避免了铜离子对细胞的毒性，可在活细胞内、活体组织中实现高效、特异性标记。
应用领域广泛且偏向对生物相容性要求较高的场景，在细胞生物学研究中，可用于活细胞内目标分子（蛋白、核酸、多肽）的动态追踪、相互作用分析，以及细胞增殖、迁移的实时观测；在活体成像领域，可标记靶向分子（如抗体、多肽、纳米载体）构建近红外荧光探针，用于肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病等病灶的精准定位、边界识别、动态监测及手术导航，尤其适用于对铜离子敏感的活体模型；在药物研发中，可标记药物分子或载体，评估药物在生物体内的吸收、分布、代谢、排泄过程，以及靶向药物的递送效率和疗效，为药物优化提供数据支持；此外，还可用于免疫分析、病理切片染色、生物传感器构建等领域，在基础医学研究和临床转化中具有重要应用前景。
使用方法：
需遵循IEDDA反应特性和荧光试剂操作规范，首先配制储备液：取适量ICG-TCO粉末，加入无水DMSO溶解，配制成1-5 mM的储备液，分装为小体积（如20 μL、50 μL），置于-20℃避光密封保存，避免反复冻融。标记反应时，将含四嗪基团的目标分子与ICG-TCO储备液按摩尔比1:1.5-1:3加入反应体系，调节pH至7.2-7.6，室温避光孵育15-60分钟（反应速率快，无需长时间孵育）。对于活细胞标记，可将配制好的工作液直接加入细胞培养体系，37℃、5% CO₂培养箱中孵育30-90分钟，孵育结束后用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，去除游离染料，再进行荧光检测。对于活体成像实验，将纯化后的荧光探针通过静脉注射导入动物体内，根据探针代谢特性，在注射后不同时间点用近红外活体成像系统检测荧光信号。
注意事项：
ICG-TCO对光、温度敏感，储存时需避光、密封、低温（-20℃），可加入少量抗氧化剂防止氧化降解；
储备液避免反复冻融，使用后立即放回低温环境，未用完的储备液可在-80℃长期保存；
反应体系中避免存在强氧化剂、还原剂，以免破坏TCO基团或ICG结构，影响反应效率和荧光性能；
活细胞标记时，需控制工作液浓度，避免过高浓度导致细胞毒性；
活体实验中，探针用量需根据动物体重、实验模型优化，确保荧光信号清晰且无明显代谢负担；
检测时需选用近红外专用检测设备，设置对应激发和发射波长，避免与其他荧光信号交叉干扰。
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