欢迎来到星戈瑞荧光stargraydye! EMAIL:stargraydye@qq.com
荧光素当前位置:首页 > 资讯 > 荧光素

荧光FITC-NHS标记蛋白的实验方法和步骤

时间:2022-07-15    阅读:2757    点赞:0

星戈瑞荧光含FITC-NHS、6-FAM NHS ester、5-TAMRA, SE、Cyanine3 NHS ester、Cyanine5 NHS ester、Cy7.5 NHS ester、ICG NHS ester、BDP 630/650 X NHS ester、Pyrene azide、BDP FL maleimide、Cyanine5-alkyne等不同产品,还可提供近红外二区等特殊定制染料。

 

FITC-NHS标记蛋白的实验方法和步骤:

Fluorescein isothiocyanate (FITC,异硫氰酸荧光素)被广泛用于通过胺基将荧光标记附着到蛋白质上。异硫氰酸酯基团与蛋白质中的氨基末端和伯胺反应。它已被用于标记蛋白质,包括抗体和凝集素。

FITC-N=C=S  +  N-H2-protein  →  FITC-NH-S-C-N-H-protein

准备说明

FITC在丙酮中以1mg/mL测试溶解度和溶液外观,得到澄清的黄色溶液。它溶于5mg/mL的无水二甲基亚砜(DMSO)。它溶于水,小于0.1mg/mL,乙醇20mg/mL,2-甲氧基乙醇9mg/mL。建议使用储备溶液的无机溶剂,因为FITC在水中分解。在使用前立即将FITC稀释在碱性缓冲液中用于偶联程序。 

储存/稳定性

2°C到8°C干燥避光保存.

 

用FITC标记蛋白质的程序

1.实验前准备:

1)配100mL,0.1M PH=8.5的SB缓冲液(0-5℃保存,且不超过一周,最好现配现用);

2)准备好A,B,C,D四个石英比色皿;

3)取一小容量瓶,事先用锡箔纸将其完全包住以避光;

4)用超纯水注满D=15mm,L=300mm的柱层析分离吸附柱,过夜浸泡,同时检测其是否漏液,第二天再用PBS浸泡7-8h;

5)用DIW浸泡葡聚糖Sephadex G-50过夜(1gSephadex G-50配5mLDIW),使其溶胀,打开孔状结构;

而后将DIW倒掉,注入适量PBS(PH=7.4),用锡箔纸盖好防灰,4℃保存;
注:(1) Sephadex G-50量可以过多,过完柱层析分离吸附柱后剩余部分可加入  0.02%(m/v)NaN3,防止细菌,保存于4℃冰箱中;

(2) Sephadex G-50第一次配好后可以反复使用多次,但应做相应后处理(见后);

(3) Sephadex G-50分离范围:1000-30,000(分子量),

 

2.计算Protein中游离-NH2,配制1.0mg/mL Protein/SB蛋白溶液:
BSA,Fraktion V Mw=67000Da, Arg 26个;lys 60个;20mg BSA;2mLSB(0.1M PH=8.5);

游离-NH2:n1=20×0.001g×(26+60)/(67000g.mol-1) =2.57×10-5mol;
溶于小容量瓶中(外包锡箔纸避光处理),加搅拌子搅拌,使其完全溶解;

注:组成蛋白质的20中氨基酸中,仅Arg,lys在侧链上有游离的-NH2。

3.求算FITC的量:

5.8mg FITC,5.8mLDMSO(干燥),溶于5mL冻溶管中;注:

(1) 配好后分装于0.5mL离心管中,-69°C保存,之后可以直接使用。

(2) FITC的量应适中,以使蛋白质中所有游离的-NH2均与FITC反应,

FITC量较少→未反应-NH2较多→F/P低;

FITC量过多→F/P高;

(2)对BSA,取已配好的150uL 1.0mg/mLFITC/DMSO,

故FITC:n2=0.15×1.0×0.001/389.4 mol =0.385×10-6mol

  

4.FITC标记Protein反应:

用移液器每次取10ul,间隔、缓慢加入BSA/SB蛋白溶液中;
全部加完后,搅拌、混合一会,转入4℃,黑暗中反应8h(冰箱内);

注:加入FITC的过程中应注意避光。

  

5.测1.0mg/mL Protein/SB蛋白溶液在280nm处的吸光系数E%0.1。

配制3mL 1.0mg/mL BSA/SB蛋白溶液(5mL冻溶管中),用“UV-7504紫外可见分光光度计”测其在280nm处的吸光系数E%0.1。
A:3mLSB,按“0ABS/100%T”清零(清零时用相应蛋白质溶液的溶剂);
B:3mL1.0mg/mL BSA/SB&am


0