ICG-SH，吲哚菁绿-巯基 近红外功能化染料，适配纳米载体标记与共价偶联
ICG-SH（吲哚菁绿-巯基）是一种功能化近红外荧光染料，由吲哚菁绿（ICG）与巯基（-SH）通过共价键连接而成，兼具ICG的近红外荧光示踪能力与巯基的高化学活性，荧光发射波长约790-820nm，激发波长约770-790nm，处于近红外光谱区，生物组织穿透能力强，背景荧光干扰低，巯基的引入为染料提供了可控的化学反应位点，可实现与多种活性组分的高效偶联，广泛应用于纳米颗粒标记、金属表面功能化、生物分子偶联、体内外成像、药物递送系统追踪等科研领域。本使用说明详细介绍其使用方法、操作要点、注意事项及实验优化建议，确保实验操作规范、结果可靠，同时补充共价偶联的专属技巧，助力科研实验高效开展。
一、试剂基本信息。
本品外观为深绿色至蓝绿色固体或溶液，纯度≥95%，荧光亮度高、光稳定性优良，适合长时间动态追踪实验，ICG作为经典的近红外染料，其光谱范围可有效减少生物组织的自发荧光干扰，提高成像信号的灵敏度和信噪比。巯基（-SH）是一种活泼的官能团，可与金属表面（如金纳米颗粒）、马来酰亚胺修饰分子、或其他硫醇活性组分发生共价连接，形成稳定的硫醚键，在不影响荧光性能的情况下实现高效偶联。试剂溶解性良好，可溶解于去离子水、PBS缓冲液等水相体系，也可溶于DMSO、DMF等有机溶剂，在非极性有机溶剂中溶解性较差。储存条件为-20℃干燥避光密封保存，避免反复冻融，开封后建议1个月内用完，未开封试剂保质期为12个月，储存时需放置于防潮、防光照的试剂柜中，远离热源、氧化剂及重金属离子，防止巯基氧化或荧光降解。产品采用瓶装形式，常规规格为100mg、250mg、500mg，亦可根据客户需求提供定制包装，可根据实验需求选择固体、粉末或溶液状态。
二、实验前准备。
1. 试剂预处理：使用前将试剂从-20℃冰箱取出，放置于室温回温20-30分钟，待试剂恢复至室温后再进行称量或稀释，避免因温度骤变导致试剂结块、荧光分子变性；若为固体试剂，需在无菌、避光条件下精准称量，称量后迅速密封剩余试剂，防止吸潮、光照降解或巯基氧化。
2. 溶液配制：根据实验需求配制工作液，常规浓度范围为1-5μg/mL（活体成像）、5-10μg/mL（偶联实验），推荐使用无菌PBS缓冲液（pH7.0-7.5）或去离子水配制，若需用于疏水体系偶联，可先用少量DMSO溶解后，再用缓冲液稀释至目标浓度，稀释过程中轻轻颠倒混匀，避免剧烈震荡，防止荧光淬灭或巯基活性降低。配制完成后，可通过0.22μm无菌滤膜过滤，去除杂质与微生物，确保实验体系无菌，过滤后的工作液需立即使用，不可长时间放置，若需短期保存，可置于4℃避光条件下，保存时间不超过12小时。
3. 实验器材准备：提前将离心管、移液枪、反应瓶、活体成像系统、荧光显微镜等实验器材灭菌处理，所有接触试剂的器材需确保无氧化剂、重金属离子污染，避免导致巯基氧化；偶联实验中使用的反应瓶需提前干燥，去除水分，防止影响偶联效率；活体成像系统需提前调试，选择适配ICG的激发滤光片（770-790nm）与发射滤光片（790-820nm），预热10-15分钟，校准成像参数。
三、操作步骤。
（一）纳米颗粒标记实验。
1. 纳米颗粒预处理：取适量纳米颗粒（如金纳米颗粒、脂质体纳米颗粒），用PBS缓冲液洗涤2-3次，离心（转速5000-10000rpm，时间5-10分钟），去除残留杂质，调节纳米颗粒浓度至适宜范围（100-500μg/mL）。
2. 偶联反应：将配制好的ICG-SH工作液加入纳米颗粒溶液中，按ICG-SH与纳米颗粒的质量比1:10-1:50混合，在室温、避光条件下搅拌孵育1-2小时，搅拌速度控制在100-200rpm，确保试剂均匀混合，使巯基与纳米颗粒表面的活性基团发生共价结合。
3. 纯化与检测：孵育结束后，通过离心、透析或凝胶过滤法纯化，去除未结合的游离ICG-SH，离心转速可根据纳米颗粒粒径调整（10000-15000rpm），透析时间为24-48小时，期间更换2-3次缓冲液；纯化后，通过荧光光谱仪检测荧光强度，验证标记效果，或通过透射电镜观察纳米颗粒形态，确认标记后纳米颗粒无聚集。
4. 成像与应用：标记后的纳米颗粒可用于体内外成像实验，体外实验可加入细胞培养体系，观察细胞摄取情况；体内实验可通过尾静脉注射，通过活体成像系统监测纳米颗粒在体内的分布、靶向性及代谢情况。
（二）生物分子偶联实验。
1. 生物分子预处理：取适量待偶联生物分子（如蛋白质、抗体、多肽），用PBS缓冲液（pH7.0-7.5）透析，去除氨基、巯基等干扰基团，调节生物分子浓度至1-10mg/mL。
2. 偶联反应：将ICG-SH工作液与生物分子溶液按适宜比例混合，加入少量催化剂（如DTT），在室温、避光条件下孵育2-4小时，孵育过程中轻轻摇晃反应瓶，确保偶联充分，巯基与生物分子表面的活性基团形成稳定的共价键。
3. 纯化与鉴定：孵育结束后，通过凝胶过滤层析或透析法纯化，去除未结合的游离ICG-SH及催化剂，纯化后，通过SDS-PAGE电泳鉴定偶联效果，或通过荧光光谱仪检测荧光强度，确认偶联成功。
4. 应用：偶联后的生物分子可用于免疫荧光、Western blot、活体成像等实验，评估生物分子的分布、结合能力及代谢情况。
（三）活体成像实验。
1. 动物预处理：将实验动物（如小鼠、大鼠）称重、标记，麻醉后固定于活体成像系统的载物台上，剃去实验区域毛发，确保成像区域无遮挡。
2. 试剂注射：将配制好的ICG-SH工作液按1-3mg/kg体重的剂量，通过尾静脉缓慢注射，注射速度控制在0.1-0.2mL/min，避免血管损伤或试剂外漏。
3. 成像与监测：注射后不同时间点（如30min、1h、3h、6h、12h），将动物置于活体成像系统中，拍摄荧光图像，记录试剂在体内的分布、富集及代谢情况；可通过成像软件定量分析荧光强度，评估试剂在目标器官的富集效率，实验过程中设置空白对照组，排除背景荧光干扰。
四、注意事项。
1. 避光操作：ICG-SH对光照敏感，全程需在避光条件下进行，包括试剂称量、溶液配制、孵育、清洗及成像等步骤，可使用锡箔纸包裹容器，实验环境选择暗室或弱光环境，避免强光直射导致荧光光漂白；偶联反应和成像过程中，尽量缩短试剂暴露在光照下的时间。
2. 巯基保护：巯基易被氧化，实验过程中需避免体系中存在氧化剂、重金属离子，可加入少量还原剂（如DTT、β-巯基乙醇）保护巯基活性；配制好的工作液需立即使用，避免巯基氧化失效。
3. 浓度控制：工作液浓度需严格按照实验需求配制，偶联实验中浓度过高可能导致非特异性偶联，浓度过低则偶联效率低下；活体成像浓度过高可能导致荧光淬灭或脏器毒性，浓度过低则荧光信号微弱，无法准确检测；建议实验前进行预实验，确定工作浓度。
4. 无菌操作：实验过程中需严格遵循无菌操作规范，防止试剂污染，若试剂不慎污染，应立即丢弃，不可继续使用；接触试剂的器材需单独使用，避免与其他试剂交叉污染，尤其是氧化剂、氨基类试剂。
5. 储存与处理：剩余试剂需密封后立即放回-20℃冰箱，建议分装成小份储存，避免反复冻融；实验结束后，废弃的试剂及耗材需按照生物安全规范处理，含试剂的废液需收集后进行无害化处理，固体废弃物需密封后交由专业机构处理；偶联后的产物需置于4℃避光保存，短期使用，避免长期储存导致活性降低。
五、应急处理。
1. 皮肤接触：若试剂接触皮肤，立即用大量流动的清水冲洗接触部位15-20分钟，若出现红肿、瘙痒等不适，及时就医。
2. 眼睛接触：若试剂溅入眼睛，立即用大量生理盐水冲洗眼睛20分钟以上，期间转动眼球，确保眼睛各部位均被冲洗，随后及时就医。
3. 误食：若不慎误食，立即催吐，并及时就医，告知医生试剂名称及成分，不可自行用药。4. 试剂泄漏：若试剂发生泄漏，立即用吸水纸吸干泄漏物，并用酒精擦拭污染区域，密封泄漏物后按危险废弃物处理，处理时佩戴手套、口罩等防护用品，避免直接接触泄漏物。
六、补充说明。
本品仅用于科研实验，严禁用于人体、医疗或诊断用途；ICG-SH的巯基端可灵活实现与多种材料的偶联，尤其适合纳米颗粒、金属表面的功能化标记，偶联效率高，且不影响荧光性能；偶联反应的温度、pH值、反应时间会影响偶联效果，建议优化反应条件（通常室温、pH7.0-7.5、反应1-4小时）；若需提高偶联效率，可适当增加ICG-SH的用量，或加入催化剂；活体成像时，ICG-SH的代谢主要通过肝脏和肾脏，实验过程中可监测肝脏、肾脏的荧光信号变化，评估代谢情况；偶联后的产物可结合多模态成像技术，提升实验研究的全面性；实验过程中需注意保护巯基活性，避免氧化导致偶联失败，若巯基发生氧化，可加入还原剂进行还原处理后再使用。
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