CY5标记的微小RNA（Cy5-microRNA）是将近红外荧光染料Cy5与微小RNA（microRNA）通过特异性偶联形成的荧光探针，兼具microRNA的基因调控功能与Cy5的高灵敏近红外荧光特性，是microRNA表达检测、功能研究、递送效率评估的核心工具，本指南将详细说明其产品特性、使用方法、操作注意事项及应用要点，助力科研人员精准开展相关实验。
产品核心特性：
Cy5作为近红外荧光染料，激发波长约649nm，发射波长约670nm，荧光量子产率高、光稳定性强、组织穿透能力较强，可有效降低生物样本的背景荧光干扰，适合细胞成像、组织切片成像及活体成像。microRNA作为长度约22个核苷酸的非编码RNA，通过调控靶mRNA的表达参与细胞增殖、分化、凋亡等多种生理病理过程，其异常表达与肿瘤、遗传病等密切相关。Cy5与microRNA的偶联采用5’端或3’端氨基修饰偶联方式，反应条件温和，不破坏microRNA的碱基配对能力、基因调控活性及核酸酶抗性，标记后探针荧光信号稳定，可实现对microRNA的实时可视化追踪。
使用方法与步骤：
第一步，探针制备与稀释。将Cy5-microRNA冻干粉从-20℃冰箱取出，室温避光解冻10分钟，加入RNase-free无菌水或TE缓冲液（pH 7.0-7.5），轻柔混匀后离心（12000rpm，1min），配制为10-50μmol/L的母液，分装为单次用量（避免反复冻融），母液可在-20℃避光保存1个月。实验时根据需求用RNase-free缓冲液稀释至工作浓度（细胞实验0.1-5μmol/L，活体实验0.05-1μmol/L），稀释后现配现用。
第二步，细胞转染与孵育。细胞接种于培养皿或孔板，培养至汇合度达60%-80%时进行转染，将稀释后的Cy5-microRNA与转染试剂（如Lipofectamine）按比例混合（通常转染试剂:探针体积比为2:1），室温孵育15-20分钟形成复合物，加入细胞培养体系中，37℃、5%CO₂培养箱孵育4-24小时，根据实验需求选择孵育时间。
第三步，荧光检测。孵育完成后，吸弃培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次（去除未转染的游离探针），加入4%多聚甲醛固定15分钟（可选），再用PBS洗涤后，通过荧光显微镜、共聚焦显微镜（近红外通道）观察荧光信号，或通过流式细胞仪量化转染效率。
注意事项与应用提示：
储存方面，需全程避光，母液-20℃密封保存，加入RNase-free保护剂防止核酸降解，避免反复冻融超过3次；操作过程中需使用RNase-free耗材（离心管、移液枪头、培养皿），全程戴手套，防止RNase污染导致探针降解。实验设计需设置对照组：空白对照组（无探针）、未标记microRNA对照组（验证基因调控活性）、Cy5空白对照组（排除非特异性荧光）。转染时需优化转染试剂用量、探针浓度、孵育时间，不同细胞系转染效率差异较大，需提前预实验确定条件；荧光成像时，近红外通道需优化曝光时间与增益，避免光漂白，可使用抗淬灭剂延长信号保存时间。该探针广泛应用于microRNA功能研究、基因调控网络分析、核酸递送系统评估、肿瘤标志物检测等领域，使用时需结合具体实验目的调整参数，确保实验结果的准确性与可靠性。
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