Cy3 NHS、Cy7 NHS（花菁染料标记活性酯）的合成工艺、标记反应条件及生物大分子偶联应用技术
中文名：花菁染料标记活性酯
英文名：Cyanine dye-labeled N-hydroxysuccinimide ester
别称：Cy3 NHS、Cy7 NHS。
简单描述：
花菁染料的N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物，是生物偶联领域常用活性荧光标记试剂，Cy3 NHS与Cy7 NHS合成路线相似，核心是构建共轭体系并引入活性酯基团。优化后纯度均达98%以上，磺化衍生物水溶性更优。标记反应需精准控制介质、pH、摩尔比等参数，*优条件下偶联效率高。可广泛标记蛋白质、抗体、多肽等生物大分子，用于细胞成像、肿瘤精准成像、多肽-受体相互作用研究，还可构建多色标记和多模态成像探针，应用于免疫检测技术。
合成工艺：
Cy3 NHS和Cy7 NHS均属于花菁染料（Cyanine）的N-羟基琥珀酰亚胺酯衍生物，是生物偶联领域常用的活性荧光标记试剂，其合成工艺的核心是构建花菁染料的共轭体系并引入活性酯基团，实现与生物大分子的高效偶联。两者合成路线相似，均以2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾盐为原料，首先通过N-烷基化反应合成中间体N-对羰基苄基-2,3,3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾；随后将中间体与不同的缩合剂进行缩合反应：Cy3 NHS采用戊二烯醛缩苯胺盐酸盐作为缩合剂，Cy7 NHS采用庚二烯醛缩苯胺盐酸盐作为缩合剂，在氮气保护下，于醋酐-吡啶混合液中加热至110℃回流反应10分钟，生成具有共轭结构的花菁染料母体。*后通过酰化反应引入NHS活性酯基团：将花菁染料母体溶于二氯甲烷中，加入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和二环己基碳二亚胺（DCC），室温搅拌反应4小时，通过过滤去除副产物二环己基脲，经柱层析纯化（洗脱剂为二氯甲烷-甲醇=10:1）获得目标产物。优化后的合成工艺可使产物纯度达到98%以上，其中Cy3 NHS纯度可达98.98%，显著降低了杂质对后续偶联反应的影响。为改善水溶性，可在合成过程中引入磺酸基，制备磺化Cy3 NHS和磺化Cy7 NHS，其水溶性较非磺化产物提高5倍以上，且光稳定性更优。
标记反应条件的精准控制是确保Cy3 NHS、Cy7 NHS与生物大分子高效偶联的关键，两者反应条件相似，核心参数包括反应介质、pH值、染料与底物摩尔比、反应温度和时间。*优反应条件如下：反应介质选择不含伯胺（如Tris、甘氨酸）的缓冲液，避免干扰活性酯与氨基的反应，常用PBS缓冲液（pH 7.2-7.4）或碳酸盐缓冲液（pH 8.0-8.5）；待标记生物大分子（蛋白质、抗体等）浓度需控制在2-10 mg/mL，浓度过低会导致标记效率显著下降，例如IgG抗体浓度低于2 mg/mL时，标记效率降低40%以上。染料与生物大分子的*佳摩尔比为10:1，可通过公式精准计算染料用量：以500 μL 2 mg/mL IgG（分子量150 kDa）为例，所需Cy3 NHS体积约为3.95 μL（10 mg/mL储备液）。
反应在室温、避光条件下进行60分钟，期间每10-15分钟轻轻颠倒混匀一次，避免剧烈搅拌导致生物大分子变性。反应完成后，需立即进行纯化，常用方法包括凝胶过滤层析（Sephadex G-25）和透析法，以去除游离染料和反应副产物。对于易氧化的生物大分子，反应需在氮气保护下进行，长期储存需充氮气密封，置于-80℃避光保存。
用途：
Cy3 NHS和Cy7 NHS凭借优异的光学性能和高效的偶联活性，在生物大分子偶联应用中具有广泛应用，涵盖蛋白质、抗体、多肽等多种生物分子的荧光标记。
在蛋白质标记应用中，可用于标记牛血清白蛋白（BSA）、转铁蛋白等，构建荧光探针用于细胞成像和药物递送。例如，采用Cy3 NHS标记BSA，偶联效率可达95%以上，标记产物在激发波长550 nm、发射波长570 nm处具有强荧光信号，可用于追踪BSA在细胞内的转运过程。在抗体标记领域，Cy7 NHS标记的单克隆抗体可作为靶向荧光探针，用于肿瘤的精准成像，其近红外荧光（激发波长750 nm，发射波长770 nm）具有深层组织穿透能力，可有效减少组织自发荧光干扰，在活体肿瘤成像中信噪比可达10:1以上。在多肽标记应用中，可通过固相合成法将Cy3 NHS标记到多肽的氨基末端，构建荧光标记多肽探针，用于研究多肽与受体的相互作用机制，例如标记生长因子多肽，通过荧光信号变化监测其与细胞膜受体的结合过程。
在生物大分子偶联应用技术中，多色标记和多模态成像技术是近年来的研究热点。
通过Cy3 NHS（红光）与FITC（绿光）的组合使用，可实现对两种不同生物大分子的同步示踪，例如在蛋白质相互作用研究中，分别标记两种相互作用蛋白，通过共聚焦显微镜观察荧光共定位情况，直观揭示蛋白间的结合位点。Cy7 NHS与磁性纳米颗粒的偶联可构建多模态成像探针，兼具近红外荧光成像和磁共振成像（MRI）功能，在肿瘤诊断中可实现从分子水平到组织水平的全面检测。此外，偶联产物还可应用于免疫检测技术，如酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术，通过荧光信号放大实现对目标分子的高灵敏度检测，检测限可达0.1 nM。应用过程中需注意，标记度的控制对生物大分子活性至关重要，过度标记会导致生物大分子构象变化，降低其生物活性，通常控制标记度为2-5个染料分子/1个生物大分子。
