Cy5.5-BSA（近红外染料Cy5.5标记牛血清白蛋白）的制备、稳定性分析及体内外药物递送载体应用
近红外染料Cy5.5标记牛血清白蛋白
中文名：近红外染料Cy5.5标记牛血清白蛋白
英文名：Cy5.5-labeled Bovine Serum Albumin
别称：Cy5.5-BSA。
简单描述：
近红外荧光染料Cy5.5与牛血清白蛋白（BSA）共价偶联的功能性荧光探针，融合BSA优良生物相容性与Cy5.5优异近红外成像性能。采用NHS酯化法制备，室温避光反应60分钟，经凝胶过滤层析纯化和超滤浓缩，纯度达98%以上，偶联度1.7个Cy5.5分子/1个BSA分子。稳定性佳，生理介质中4℃避光可稳定2年以上。兼具靶向递送与实时示踪功能，是优质药物递送载体，也可用于血管成像和肿瘤手术导航。
Cy5.5-BSA是由近红外荧光染料Cy5.5与牛血清白蛋白（BSA）共价偶联形成的功能性荧光探针，结合了BSA优良的生物相容性和Cy5.5优异的近红外成像性能，在药物递送和精准医疗领域具有重要应用。其制备工艺的核心是在温和条件下实现高效偶联，同时保留BSA的载体功能和生物活性。主流制备方法采用NHS酯化法：首先将BSA溶解于PBS缓冲液（pH 7.4）中，配制浓度为5 mg/mL的母液，确保BSA分子充分溶解并保持天然构象；将Cy5.5-NHS酯溶于无水DMSO制备10 mM储备液，按照Cy5.5与BSA摩尔比10:1的比例缓慢滴加至BSA溶液中，滴加过程中持续轻柔搅拌，避免局部浓度过高导致蛋白变性。反应在室温、避光条件下进行60分钟，期间每15分钟轻轻颠倒混匀一次，确保反应均匀进行。反应完成后，采用凝胶过滤层析（Sephadex G-50）进行纯化，以PBS（pH 7.4）为洗脱液，收集第一个荧光峰组分，去除游离的Cy5.5-NHS酯和反应副产物；*后通过超滤浓缩（截留分子量50 kDa）获得浓度为10 mg/mL的Cy5.5-BSA溶液，经HPLC分析纯度可达98%以上，偶联度为1.7个Cy5.5分子/1个BSA分子。该工艺的关键控制点包括反应pH值（7.2-7.6）、反应温度（20-25℃）和染料与蛋白的摩尔比，这些参数直接影响偶联效率和产物稳定性。
稳定性分析是评估Cy5.5-BSA应用价值的重要指标，主要包括化学稳定性、光学稳定性和生物稳定性三个维度。化学稳定性方面，在PBS缓冲液（pH 7.4）、生理盐水等生理介质中，4℃避光保存时，Cy5.5-BSA可稳定存在2年以上，共价键连接牢固，无明显染料脱落现象；在极端pH条件（pH<5.0或pH>9.0）下，偶联键会发生轻微水解，染料脱落率约为5-8%。光学稳定性测试表明，在室温避光条件下放置30天，其荧光强度保留率达92%以上；在模拟体内光照条件下（波长675-690 nm，强度2 mW/cm²）持续照射2小时，荧光强度衰减率仅为8%，显著优于传统荧光染料。生物稳定性方面，在血清环境中（含50%胎牛血清）37℃孵育72小时，Cy5.5-BSA的荧光强度和分子量无明显变化，表明其具有良好的抗酶解能力；体内代谢实验显示，该复合物在小鼠体内的血液循环半衰期约为8小时，主要通过肝脏代谢排出，无明显蓄积现象。加速老化试验（40℃/75%相对湿度）验证表明，其荧光强度年衰减率小于10%，满足长期储存和应用需求。
作为药物递送载体，Cy5.5-BSA兼具靶向递送和实时示踪功能，在体内外药物递送系统中展现出独特优势。体外药物递送应用中，Cy5.5-BSA可通过疏水相互作用和静电作用负载疏水性药物（如阿霉素、紫杉醇），载药率可达15-20%。采用Cy5.5-BSA负载阿霉素构建的纳米递送系统，对肝癌HepG2细胞具有显著的靶向性，通过增强渗透和滞留效应（EPR）在肿瘤细胞内富集，药物释放量在pH 5.0的肿瘤微环境中是pH 7.4生理环境的3.2倍，实现了pH响应型药物释放。激光共聚焦显微镜观察显示，载药复合物在细胞内的荧光信号随孵育时间延长而增强，表明药物被有效摄取并释放到细胞质中。体内药物递送应用中，Cy5.5-BSA载药系统通过尾静脉注射进入肿瘤小鼠模型后，可通过近红外活体成像系统实时监测药物在体内的分布和富集过程，注射后6小时在肿瘤部位的荧光强度达到峰值，是正常组织的4.5倍。动物实验表明，该递送系统可显著提高药物的肿瘤靶向性，降低对正常组织的毒性，与游离药物相比，肿瘤抑制率提高了35%，同时小鼠体重变化率小于5%，生物安全性良好。此外，Cy5.5-BSA还可用于血管成像和手术导航，在肿瘤切除手术中，通过近红外成像可清晰区分肿瘤组织与正常组织，提高手术切除的精准度，减少残留病灶。
