水溶 CY5.5 NHS 酯：近红外荧光标记的氨基靶向核心工具
水溶 CY5.5 NHS 酯（磺酸化 CY5.5 琥珀酰亚胺酯，Sulfo CY5.5 NHS Ester）是一种基于花菁染料骨架的高性能荧光标记试剂，通过在 CY5.5 核心结构中引入磺酸基团（-SO₃H）和 N - 羟基琥珀酰亚胺酯（NHS Ester）活性基团，实现了氨基特异性标记、高效水溶性及近红外荧光性能的深度整合。其核心优势在于 NHS 酯对氨基（-NH₂）的高选择性偶联和磺酸化修饰带来的生物相容性提升，成为蛋白质、抗体、多肽等生物分子标记的理想工具。
一、分子结构与核心特性
1. 三维结构解析
水溶 CY5.5 NHS 酯的分子结构由三大功能模块构成：
CY5.5 荧光核心：双吲哚花菁共轭体系，决定近红外光吸收（激发波长 673 nm）和发射（发射波长 691 nm）特性，消光系数高达 250,000 M⁻¹cm⁻¹，量子产率约 0.35（磺化版本），光稳定性较非磺化 CY5.5 提升 40%。
磺酸基团（3 个 - SO₃H）：均匀分布于分子骨架，赋予超强水溶性（溶解度 > 80 mg/mL in H₂O），并通过负电荷排斥效应显著降低非特异性吸附，尤其适合标记抗体、酶等对疏水环境敏感的生物分子。
NHS 酯基团（-OSu）：含活性酯键，在中性 pH 条件下与氨基发生亲核取代反应，形成稳定酰胺键，反应特异性 > 99%，副产物为无荧光干扰的 NHS。
2. 关键理化参数
二、氨基靶向的生物共轭反应
NHS 酯基团是水溶 CY5.5 NHS 酯的核心反应位点，通过亲核取代反应与氨基特异性结合，反应机制如下：
1. 反应原理与动力学
活化机制：NHS 酯的活性酯键在中性 pH 下与氨基（如蛋白质赖氨酸残基、核酸 5'- 氨基修饰位点）发生亲核加成，酯键断裂后形成稳定酰胺键，反应无需额外活化剂，副产物仅为 NHS。
动力学特性：50 μM 浓度下，反应半衰期 < 15 分钟，标记效率随染料 / 蛋白摩尔比（建议 5-15:1）升高而增加，抗体标记时每个 IgG 分子平均偶联 2-3 个染料分子（通过 OD₂₈₀/OD₆₇₃比值精确计算）。
缓冲液选择：优先使用不含游离氨基的缓冲液（如 PBS、MES），避免 Tris 等胺基缓冲液竞争反应位点，推荐反应 pH 7.5-8.5。
2. 典型标记流程（以抗体为例）
① 母液制备：1 mg Sulfo CY5.5 NHS 酯溶于 100 μL PBS（pH 7.4），制备 10 mM 母液（现配现用，避免长时间放置）；② 偶联反应：抗体（1 mg/mL）与染料按摩尔比 1:10 混合，室温避光振荡 30 分钟，反应体系中可添加 0.1% BSA 减少非特异性吸附；③ 纯化分离：通过 PD-10 凝胶过滤柱或 10kDa 超滤管去除未结合染料，HPLC 检测标记纯度 > 92%，标记抗体的抗原结合活性保留率 > 95%。
三、多维度应用场景
1. 生物分子高效标记
抗体标记：用于流式细胞术（如 CD4⁺/CD8⁺ T 细胞分型）、免疫荧光染色（肿瘤组织抗原定位），近红外信号可降低组织自发荧光干扰，提升低丰度抗原检测灵敏度。例如，标记抗 HER2 抗体后，在乳腺癌小鼠模型中实现肿瘤表面 HER2 受体的精准成像，荧光信号强度比传统 Cy3 标记抗体高 60%。
蛋白质组学研究：标记细胞裂解液中的氨基化蛋白，结合质谱分析（如 iTRAQ 技术），定量检测药物处理前后的蛋白表达差异，检测限低至 5 ng/mL，适用于磷酸化蛋白、糖基化蛋白的特异性标记。
核酸标记：通过氨基修饰的 dNTP 或寡核苷酸（如 5'-NH₂-dT），制备荧光探针用于荧光原位杂交（FISH）、基因芯片，单分子成像中可检测单个 mRNA 转录本，背景噪声比可见光染料降低 3 倍。
2. 细胞与活体成像
活细胞亚细胞结构解析：标记细胞骨架蛋白（如 α- 微管蛋白），在共聚焦显微镜下呈现高对比度的微管网络，荧光信号稳定超过 48 小时；结合超分辨显微镜（如 STORM），实现 20 nm 分辨率的线粒体膜蛋白定位。
活体肿瘤靶向成像：标记靶向肿瘤血管的 RGD 多肽，经尾静脉注射后，CY5.5 近红外信号可穿透 8 mm 厚的组织，清晰显示直径 > 0.2 mm 的肿瘤结节，肿瘤 - 背景信号比（TBR）达 6.8±1.0，优于临床常用的 ICG 探针。
3. 纳米材料功能化与药物递送
脂质体 / 聚合物纳米粒标记：通过 NHS 酯与纳米颗粒表面氨基（如壳聚糖、PEI）偶联，构建荧光标记的药物载体，实时监测纳米粒在体内的分布与释放。例如，标记阿霉素脂质体后，可通过近红外成像评估其在肿瘤组织的蓄积效率，肿瘤部位荧光强度是正常组织的 8 倍。
磁性纳米颗粒表面修饰：结合 NHS 酯与氨基化磁珠，制备荧光 - 磁性双功能探针，用于循环肿瘤细胞（CTC）的分选与检测，分选纯度 > 98%，荧光检测灵敏度达单个细胞水平。
4. 技术优势对比
四、操作规范与注意事项
1. 储存与溶解
储存条件：避光、防潮，-20°C 冷冻保存，分装为 10-50 μg / 管以避免反复冻融，保质期长达 12 个月。
溶解方法：直接溶于 pH 7.4 PBS 或 HEPES 缓冲液（1-10 mM），若出现浑浊可短暂超声处理（<30 秒），避免使用含叠氮钠的缓冲液（可能导致 NHS 酯水解）。
2. 标记优化策略
摩尔比控制：抗体标记时，染料 / 蛋白摩尔比建议 8-12:1，过高比例可能因空间位阻影响抗体亲和力；多肽标记时，推荐 1:1-5:1 以平衡标记效率与生物活性。
pH 调节：反应初始 pH 需严格控制在 7.5-8.5，可用 1 M NaOH 或 HCl 微调，酸性条件（pH<6）会导致 NHS 酯水解，标记效率下降> 50%。
3. 安全与防护
操作时佩戴防紫外线手套和护目镜，避免染料接触皮肤或黏膜；NHS 酯具有轻微刺激性，若不慎接触，立即用大量清水冲洗并就医。
标记后样品建议 24 小时内使用，长期保存需添加 0.02% 叠氮钠并避光冷藏（4°C），使用前离心（10,000 rpm, 5 分钟）去除可能的沉淀。
五、前沿应用与未来展望
1. 超分辨成像与单分子定位
利用 CY5.5 长波长特性和 NHS 酯的定点标记，结合 STORM 技术实现 20 nm 分辨率的细胞膜蛋白簇成像，已成功解析 GPCR 受体在活细胞表面的动态寡聚化过程，相关研究发表于《Nature Methods》。
2. 多模态诊疗一体化探针
将水溶 CY5.5 NHS 酯与放射性核素（如⁶⁴Cu）或磁共振造影剂（如 Gd³⁺）偶联，构建荧光 / PET/MRI 三模态探针，在卵巢癌模型中实现分子靶向成像（CY5.5）、代谢示踪（PET）与解剖定位（MRI）的同步检测，指导精准手术切除。
3. 智能响应型荧光探针开发
通过引入 pH 响应型连接臂（如酸敏感腙键），设计 NHS 酯修饰的 CY5.5 前药探针，在肿瘤微环境（pH 6.5）中释放荧光信号，实现癌症的特异性激活成像，信噪比提升 4 倍以上，为荧光引导手术提供新型工具。
结语
水溶 CY5.5 NHS 酯凭借其氨基靶向的高效性、近红外荧光的深穿透性及磺酸化修饰的生物相容性，成为现代生物医学研究中荧光标记技术的核心工具。从基础分子生物学研究到临床前精准诊断，其应用覆盖了从单分子检测到活体器官成像的全维度需求。随着标记技术的创新（如基因编码定点标记）和成像设备的升级（如多光子荧光断层扫描仪），水溶 CY5.5 NHS 酯有望在超分辨成像、个性化诊疗及纳米生物技术领域发挥更关键的作用，推动荧光标记技术向更高效率、更精准化的方向迈进。
参考文献
[1] Haugland R P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals[M]. Thermo Fisher Scientific, 2013.[2] Chatterjee A, et al. Cyanine dyes in cancer nanomedicine: from imaging to therapy[J]. Chemical Society Reviews, 2017, 46(19):5832-5856.[3] Juarez O, et al. Bioconjugation strategies for fluorescent labeling of antibodies[J]. Methods, 2018, 143:3-11.[4] Cai W, et al. Surface engineering of nanoparticles for in vivo targeting and imaging[J]. Nature Biotechnology, 2008, 26(8):819-826.[5] Nimmerjahn F, et al. Single-molecule tracking of membrane proteins using near-infrared cyanine dyes[J]. Nature Methods, 2020, 17(3):289-292.
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