CY5-MAL（花菁染料CY5-马来酰亚胺） 是一种重要的近红外荧光标记试剂，专用于与生物分子（主要是含游离巯基 (-SH) 的分子）进行特异性共价偶联，广泛应用于生物共轭、分子成像和生物传感领域。
以下是关于它的关键信息解析：
1. 核心结构：花菁染料 CY5
类型： 属于磺化花菁染料 (sulfo-Cyanine dye) 家族（通常带有磺酸基团以增强水溶性）。
荧光特性：
激发波长 (Ex)： 约 649 nm (*大激发)
发射波长 (Em)： 约 670 nm (*大发射，明亮的远红/近红外荧光)
优势：
近红外窗口： 发射光位于生物组织的光学窗口（650-900 nm），在此波段组织自发荧光低、光散射少、穿透深度相对较深，非常适用于活体成像、深层组织成像。
高灵敏度： 荧光量子产率高，信噪比好。
光稳定性： 通常优于 FITC 等可见光染料（但仍需注意避光）。
多路复用： 可与发射光在绿色（如 FITC）、橙色（如 Cy3）、红色（如 Cy3.5）等波段的染料搭配，进行多色标记和成像。
水溶性： `sulfo-CY5-MAL` 是常见形式，其磺酸基团使其具有良好的水溶性，便于在生理缓冲液中进行标记反应。也存在非磺化形式（水溶性较差）。
2. 反应基团：马来酰亚胺 (MAL, Maleimide)
反应对象： 高度特异性地与游离巯基 (-SH) 反应。
蛋白质：半胱氨酸 (Cysteine) 残基上的巯基。
肽：含有半胱氨酸的肽段。
其他含巯基分子：如还原型谷胱甘肽 (GSH)、某些合成分子（如硫醇化寡核苷酸、含硫醇的聚合物/纳米颗粒）等。
反应机理： 通过迈克尔加成反应 (Michael Addition)，形成稳定的硫醚键 (Thioether Linkage)。
反应条件：
pH： *佳反应 pH 为 6.5 - 7.5 (中性至微酸性)。在碱性条件下 (pH > 8.5)，马来酰亚胺可能发生水解而失活，且特异性降低（可能与氨基发生副反应）。
温度： 通常在室温 (20-25°C) 或 4°C 下进行数小时至过夜。
还原剂： 反应前通常需要用温和还原剂（如 TCEP (三(2-羧乙基)膦) 或 DTT (二硫苏糖醇)）处理样品，以还原二硫键 (-S-S-) 并确保目标巯基处于游离、反应性状态。反应完成后需去除或淬灭过量还原剂（TCEP 通常更易去除且更稳定）。
避光： 整个操作过程需严格避光，以保护荧光团。
特异性： 相对于氨基（如赖氨酸的 ε-氨基）标记试剂（如 NHS 酯），马来酰亚胺对巯基的特异性非常高，是实现位点特异性标记（尤其是针对蛋白质上的特定半胱氨酸）的首选策略。
3. 主要应用领域：
蛋白质标记： *广泛的应用。标记抗体用于荧光免疫检测（WB, IF, IHC, Flow Cytometry）、生物传感器构建；标记酶、受体、转运蛋白等用于功能与定位研究；标记治疗性蛋白（如抗体-药物偶联物 ADC 的 linker-payload 部分）用于追踪。
肽标记： 标记含半胱氨酸的肽段，用于受体结合研究、细胞摄取实验、活体示踪等。
寡核苷酸标记： 标记硫醇化修饰的 DNA 或 RNA 探针，用于 FISH、分子信标、纳米结构组装等。
纳米颗粒/聚合物标记： 将 CY5 荧光引入功能化的纳米材料（如金纳米粒、脂质体、聚合物胶束）表面，用于成像、追踪和靶向递送研究。
活细胞与活体成像：
细胞标记： 标记细胞表面蛋白（如受体）或透膜后标记胞内蛋白（需注意透膜方法可能影响细胞活性）。
体内成像： 利用其近红外特性，用于小动物（小鼠、大鼠）的肿瘤成像、干细胞追踪、药物分布研究、血管成像、淋巴系统成像等。常标记抗体、肽、纳米载体等作为探针。
荧光共振能量转移 (FRET)： 作为能量受体（Acceptor），与合适的供体（Donor，如 Cy3）配对，用于研究分子间相互作用、构象变化、酶活性等。
4. 关键优势：
巯基特异性高： 实现位点选择性标记。
近红外荧光： 适用于活体成像和减少背景干扰。
标记效率高： 反应通常快速且高效。
稳定性好： 形成的硫醚键在生理条件下非常稳定。
商业化程度高： 易于获取，有多种衍生物（如不同水溶性、不同反应基团）。
5. 重要注意事项：
巯基状态： 确保目标巯基是游离的（需充分还原），且反应体系中无高浓度竞争性含巯基小分子（如 β-巯基乙醇、DTT，需在标记前去除或淬灭）。
pH 控制： 严格控制反应 pH 在 6.5-7.5，避免碱性条件导致的水解和副反应。
避光操作： 全程避光保存和操作，防止染料光漂白。
浓度优化： 染料与目标物的比例需优化，避免过度标记导致目标物失活或聚集，或标记不足导致信号弱。
纯化： 反应后通常需要通过透析、凝胶过滤层析（如脱盐柱）、HPLC 等方法去除未反应的游离染料。
储存： 干燥品应避光、-20°C 保存。溶解后（如 DMSO 或水溶液）应分装避光冷冻（-20°C 或更低），避免反复冻融。避免接触强氧化剂、强还原剂。
潜在副反应： 在非常高的 pH 或长时间反应下，马来酰亚胺可能与伯胺发生缓慢反应（形成 Michael 加成产物），降低特异性。严格控制条件可*大限度避免。
总结：
CY5-MAL 是一种将高性能近红外荧光染料 CY5 与高度特异性的巯基反应基团马来酰亚胺结合而成的标记试剂。它主要用于共价、位点选择性地标记含游离巯基的生物分子（尤其是蛋白质和含 Cys 的肽）。其核心价值在于结合了近红外成像的优势（活体应用、低背景）和马来酰亚胺的高特异性与稳定性，使其成为生物共轭化学、分子成像（特别是活体成像）、生物传感和功能研究中不可或缺的工具。
