要了解CY5.5及其抗体标记方法，需要从CY5.5的特性、抗体标记的必要性以及具体的标记方法等方面进行分析。
解析CY5.5染料
1. 光学特性与核心优势
激发/发射波长（Ex/Em）：通常约为CY5.5: Ex 673 nm / Em 694 nm。这个波长处于光学成像的“光学窗口”（Optical Window）的入口。
核心优势：
相较于CY5（~670nm Em）：CY5.5的发射波长更长一些，能更好地避开生物组织的自发荧光（主要存在于绿光和黄光区域），从而信噪比（SNR）更高。
相较于Cy7（~773nm Em）：CY5.5的波长更短，但其关键优势在于仪器兼容性。绝大多数标准的小动物活体成像系统（IVIS等）和共聚焦显微镜的CY5通道（通常检测695-770 nm）可以直接检测CY5.5，而无需升级专门的Cy7滤光片。这对于预算有限或设备老旧的实验室很重要。
定位：CY5.5是平衡了“良好信噪比” 和“设备兼容性” 的折中选择。
2. 化学特性
反应基团：商业化常见的CY5.5染料通常以N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS Ester） 或马来酰亚胺（Maleimide） 的形式出售。
NHS Ester：与蛋白质分子表面的赖氨酸（Lysine）ε-氨基 在碱性条件下（pH 8.5-9.5）发生亲核反应，形成稳定的酰胺键。这是常用的标记方法。
Maleimide：与蛋白质的半胱氨酸（Cysteine）巯基（-SH） 在中性偏酸性条件下（pH 6.5-7.5）发生反应，形成稳定的硫醚键。这种方法具有位点特异性。
水溶性：基础的CY5.5分子水溶性较差。因此，水溶性好的CY5.5染料通常是磺化（Sulfo） 的，即引入了磺酸基团，使其具有水溶性和更低的蛋白聚集倾向。
注：
磺化的花菁染料是水溶性的，它们在水性环境中不需要使用有机助溶剂即可进行标记。
非磺化的花菁染料需要借助有机溶剂（比如DMSO）才能在水性环境中溶解后进行标记。
3. 应用场景
活体成像（In Vivo Imaging）：非常适合浅表至中层的细胞、淋巴结或血管成像。其信噪比优于CY5，但穿透深度不及Cy7。
体外与离体成像：用于Western Blotting、细胞成像、组织切片荧光染色等，效果好。
分子探针标记：用于标记抗体、肽、纳米颗粒等各种靶向分子，构建荧光探针。
CY5.5抗体标记方法（以NHS Ester为例）
实验前准备
1. 抗体（Protein A/G纯化后的IgG为佳）：确定适宜浓度溶解后，溶于不含伯胺的缓冲液（如0.1 M NaHCO₃, pH 8.3 或 1x PBS, pH 7.4）。切记：不能使用含Tris、甘氨酸、BSA、叠氮化钠（NaN₃）的缓冲液，因为它们会与染料竞争反应。
2. CY5.5 NHS Ester染料：避光，恢复至室温。
3. 无水二甲基亚砜（DMSO）或二甲基甲酰胺（DMF）：用于溶解染料，确保无水，否则NHS酯会水解失活。
4. 纯化柱：脱盐柱或预装柱，用于去除游离染料。
5. 其他：避光容器（如用铝箔纸包裹的离心管），旋转混合仪。
标准操作步骤（Step-by-Step Protocol）
1. 计算与配制：
根据抗体量、目标染料/抗体比例计算所需染料量。
用无水DMSO将CY5.5 NHS Ester配制成高浓度储备液。现用现配，涡旋震荡确保完全溶解。
2. 标记反应：
将计算好体积的染料储备液逐滴加入抗体溶液中，同时轻轻涡旋或使用移液器缓慢吹打混匀，确保染料均匀分散。
将反应管置于避光的旋转混合仪上，室温（22-25℃） 反应60分钟或4℃反应过夜。室温反应更常用。
3. 终止与纯化：
反应结束后，可加入过量伯胺反应15分钟以终止反应，并淬灭未反应的染料。
使用预平衡好的脱盐柱纯化反应混合物，以彻底去除游离的染料分子。这是至关重要的一步，游离染料会导致极高的背景荧光。
4. 储存：产品冷冻干燥成粉末，分装，避光，于-20℃长期保存，避免反复冻融。
注意事项与疑难解答
pH：标记反应缓冲液的pH必须严格控制在8.3-9.0之间，以确保赖氨酸的ε-氨基处于去质子化的活性状态（-NH₂）。pH过低会导致标记效率急剧下降。
避光操作：CY5.5虽有一定光稳定性，但仍需全程避光操作，以防荧光淬灭。
DOL不是越高越好：过高的DOL会导致：
抗体聚集：形成二聚体或多聚体。
荧光淬灭：染料分子距离太近，发生自淬灭，荧光反而减弱。
活性丧失：染料修饰在抗原结合位点，影响抗体与抗原的结合能力。
标记后活性验证：务必进行！通过ELISA、流式细胞术或免疫荧光 comparing与未标记抗体的结合能力，确认标记过程没有损害抗体活性。
CY5.5是一个特性均衡、兼容性极佳的近红外染料。需：
1. 知其光学特性（波长、信噪比、穿透性）在光谱中的定位。
2. 知其化学特性（NHS酯反应原理、水溶性要求）。
3. 熟练掌握其抗体标记的实操细节：缓冲液选择、pH控制、DOL计算与优化、纯化必要性以及最终的活性验证。
F/P计算，举例参考，如：
CY5.5在678 nm 的摩尔吸光系数为250 000 M-1cm-1 ，所用蛋白在280 nm处的摩尔吸光系数为170 000 M-1cm-1；CY5.5在280nm处的吸收是695nm处的18%。
按以下公式计算F/P值。
[CY5.5 dye] = (A678)/250000
[peptide]=[A280-(0.18×A678)]/170000
F/P final= [dye]/[peptide]
F/P final={0.68×A678}/ {A280-(0.18×A678)}
以上数据均来自文献/科研资料,星戈瑞暂未进行独立验证, 仅供参考！(以上文中所述仅限于科研实验及实验室环境)
