Cy5-Angiopep-2 多肽（荧光标记脑靶向肽类化合物）使用指南
1. 化合物基础信息
Cy5-Angiopep-2 多肽是将 Cy5 荧光染料与 Angiopep-2 多肽（由 19 个氨基酸组成的脑靶向肽）通过肽键连接形成的靶向探针，分子量约为 2800-3000 Da，水溶性*佳（约 20-30 mg/mL，PBS 缓冲液），荧光发射波长为 660-680 nm，激发波长为 640-650 nm，量子产率 0.65-0.70，光稳定性强，在体内外均具有良好的生物相容性和靶向特异性。Angiopep-2 可特异性结合脑毛细血管内皮细胞表面的低密度脂蛋白受体相关蛋白 1（LRP1），介导探针穿越血脑屏障，靶向富集于脑实质或脑肿瘤组织，Cy5 标记后可实现对脑靶向递药过程的可视化追踪，广泛应用于脑部疾病（脑肿瘤、阿尔茨海默病、帕金森病）的诊断与治疗研究。
2. 试剂准备与储存
试剂准备：使用前将 Cy5-Angiopep-2 多肽粉末置于 4℃冰箱平衡 15 分钟，避免温度骤变导致多肽变性。推荐溶剂选择：优先使用无菌 PBS 缓冲液（pH 7.2-7.4）溶解，配制成 1 mM 母液（精确称取 2.9 mg 粉末，加入 1000 μL PBS，轻轻颠倒混匀 5 分钟至完全溶解，无需涡旋，避免多肽结构破坏）；若用于负载药物，可将母液与药物溶液（如化疗药、核酸药物）按摩尔比 1:1-1:5 混合，室温孵育 30 分钟，形成探针-药物复合物，随后用生理盐水稀释至工作浓度（细胞实验：0.5-5 μM；活体实验：5-10 mg/kg）。稀释后的工作液需在 3 小时内使用，避免多肽降解或荧光团聚。
储存条件：未开封的多肽粉末需密封置于-20℃冰箱，避光、干燥保存，保质期 24 个月。已配制的 PBS 母液需分装为 100 μL / 管，-80℃避光保存，可稳定 6 个月，严禁反复冻融（超过 2 次会导致多肽活性丧失）；探针-药物复合物不可储存，需现配现用。储存期间需避免接触蛋白酶、强酸强碱及有机溶剂，若母液出现浑浊、沉淀，需立即丢弃，不可使用。
3. 实验操作流程
细胞实验（脑微血管内皮细胞 / 脑肿瘤细胞）：
① 细胞接种：将人脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3）或脑肿瘤细胞（U251胶质瘤细胞）以 8×10⁴个 / 孔密度接种于 confocal 小皿，加入含 10% 胎牛血清的 EGM-2 培养基（内皮细胞）或 DMEM 培养基（肿瘤细胞），37℃、5% CO₂培养箱孵育 24 小时，细胞融合度达 70%-80%；② 靶向结合实验：吸弃旧培养基，PBS 洗涤 2 次，加入含 Cy5-Angiopep-2 工作液（1-3 μM）的无血清培养基，同时设置对照组（Cy5 标记的无靶向性 scramble 多肽，浓度相同），孵育 1-3 小时（内皮细胞推荐 2 小时，肿瘤细胞推荐 1.5 小时）；③ 洗涤与成像：孵育结束后，用预冷的 PBS 洗涤 4 次，每次 5 分钟，去除未结合的游离探针；加入新鲜培养基，激光共聚焦显微镜观察（激发波长 647 nm，发射波长 670 nm），记录荧光在细胞表面及细胞内的分布；④ 特异性验证：通过受体阻断实验，先向细胞中加入 10 μM 游离 Angiopep-2 多肽（LRP1 受体阻断剂），孵育 1 小时后再加入 Cy5-Angiopep-2 工作液，孵育结束后检测荧光强度，与未阻断组对比，验证靶向特异性。
活体实验（脑肿瘤 / 脑部疾病模型）：
① 模型建立：构建脑肿瘤模型时，向 Balb/c 裸鼠右脑注射 U251 胶质瘤细胞（1×10⁶个 / 只），建模后 14 天进行实验；构建阿尔茨海默病模型时，选用 APP/PS1 双转基因小鼠（6 月龄）；② 探针给药：尾静脉注射 Cy5-Angiopep-2 工作液（剂量 8 mg/kg，体积 100 μL / 只），对照组注射等量 Cy5-scramble 多肽溶液；③ 活体成像：给药后 1、2、4、6、12 小时，将小鼠麻醉（异氟烷吸入麻醉），置于近红外活体荧光成像系统中，设置激发波长 650 nm，发射波长 675 nm，采集脑部荧光图像，使用 Living Image 软件定量荧光信号强度，分析探针在脑部的富集效率及代谢动力学；④ 血脑屏障穿透验证：给药后 4 小时处死小鼠，取脑组织和外周器官（心、肝、脾、肺、肾），称重后加入 PBS 缓冲液匀浆，离心收集上清液，通过荧光分光光度计检测荧光强度，计算组织中探针的富集量（μg/g 组织），对比脑部与其他器官的富集比例；⑤ 组织学分析：取脑组织进行冰冻切片（厚度 15 μm），DAPI 染核，荧光显微镜观察探针在脑肿瘤区域、正常脑实质及脑血管的分布，通过免疫荧光染色（LRP1 抗体）验证探针与受体的共定位。
4. 注意事项与 troubleshooting
注意事项：① 多肽易受蛋白酶降解，实验全程需保持无菌操作，细胞实验中可在培养基中添加 1× 蛋白酶抑制剂，活体实验中尽量缩短给药后样本处理时间；② 操作时避免剧烈振荡或高温，配制母液时轻轻颠倒混匀，不可涡旋，防止多肽二级结构破坏；③ 近红外荧光成像时，需去除小鼠毛发（脑部脱毛或使用脱毛膏），避免毛发对荧光信号的吸收干扰；④ 细胞实验中，受体阻断实验需保证游离 Angiopep-2 多肽浓度足够（为探针浓度的 10 倍以上），确保受体完全阻断；⑤ 活体实验中，给药剂量不可超过 10 mg/kg，过高剂量可能导致小鼠体重下降或神经毒性。
常见问题解决：① 脑部荧光信号弱：可能是血脑屏障穿透不足，可优化探针剂量（提高至 10 mg/kg），或在工作液中添加 0.2% Pluronic F127，增强内皮细胞摄取；也可能是 LRP1 受体表达量低，需选择 LRP1 高表达的细胞 / 动物模型；② 非特异性结合明显：对照组荧光强度高，可能是探针浓度过高，需降低工作浓度（≤3 μM），或延长洗涤时间（每次 8 分钟）；③ 多肽降解：母液或工作液出现沉淀，可能是储存条件不当或接触蛋白酶，需严格遵循-80℃分装保存，实验中添加蛋白酶抑制剂；④ 细胞摄取效率低：可能是孵育时间不足，可延长至 3 小时，或在无血清培养基中孵育，减少血清蛋白对结合的干扰；⑤ 荧光信号重叠：若与其他荧光探针联合使用，需避免发射波长重叠（Cy5 与 FITC、罗丹明无重叠，可放心联用）。
5. 应用场景与结果分析
Cy5-Angiopep-2 多肽主要应用于脑部疾病的靶向递药与可视化研究，核心场景包括：① 脑肿瘤靶向诊断：通过活体荧光成像快速定位脑肿瘤位置，评估肿瘤大小，为手术导航提供依据；② 血脑屏障穿透递药系统优化：将探针作为靶向配体修饰纳米载体（如脂质体、量子点），观察载体穿越血脑屏障的效率，筛选优选递药系统；③ 神经退行性疾病研究：追踪探针在阿尔茨海默病模型小鼠脑内的分布，结合 Aβ 斑块染色，评估靶向清除 Aβ 的效果；④ 脑部药物疗效评估：将探针与治疗药物偶联，通过荧光强度变化反映药物在脑内的富集量，关联药效指标（如肿瘤体积缩小、神经功能改善），实现疗效的实时监测。
结果分析关键要点：① 细胞实验中，若 Cy5-Angiopep-2 组荧光强度显著高于对照组，且受体阻断组荧光强度下降≥50%，表明探针具有 LRP1 介导的特异性结合能力；② 活体实验中，若脑部荧光信号在给药后 2-4 小时达到峰值，且脑部富集量是肝脏的 3 倍以上，说明探针具有良好的血脑屏障穿透性和脑靶向性；③ 脑肿瘤模型中，若肿瘤区域荧光强度显著高于正常脑实质（比值≥4:1），表明探针可特异性富集于肿瘤组织；④ 联合药效评估时，若治疗组脑部荧光持续时间长于对照组，且肿瘤体积缩小率≥30%，说明靶向递药系统显著提升了药物的脑部生物利用度和治疗效果。
【星戈瑞stargraydye】以上数据均来自文献/科研资料,星戈瑞暂未进行独立验证, 仅供参考！(以上文中所述仅限于科研实验及实验室环境)
