FITC标记生物大分子的制备与生物相容性研究——以FITC-肝素为例
肝素是一种广泛应用于临床的天然糖胺聚糖，具备优异的*凝血活性，但其在体内的代谢路径与作用靶点难以直观追踪。异硫氰酸荧光素（FITC）作为经典的绿色荧光探针，常被用于生物大分子的标记与示踪，构建 FITC-肝素荧光探针可实现对肝素体内外行为的可视化监测，而其制备工艺与生物相容性直接决定了探针的应用价值。
FITC-肝素的制备：
需严格把控反应条件以兼顾标记效率与生物活性保留。实验采用氨基化修饰的肝素为底物，利用 FITC 分子中的异硫氰酸基团与肝素氨基的特异性共价结合实现标记。具体操作中，将肝素溶解于 0.1mol/L 的碳酸盐缓冲液（pH=9.0），按 1:5 的摩尔比缓慢滴加 FITC 的二甲基亚砜溶液，避光室温搅拌反应 8h。反应结束后，通过葡聚糖凝胶 G-25 层析柱进行纯化，去除未结合的游离 FITC，收集荧光洗脱峰并冷冻干燥，即可获得 FITC-肝素粉末。经荧光分光光度计检测，当标记摩尔比为 1:5 时，标记率可达 78%，且紫外光谱显示肝素的特征吸收峰未发生明显偏移，说明其基本结构未被破坏。
生物相容性是 FITC-肝素能否用于生物实验的核心指标，本研究从细胞毒性与血液相容性两方面展开验证。细胞毒性实验采用人脐静脉内皮细胞（HUVEC），设置不同浓度梯度的 FITC-肝素处理组，培养 24h 后通过 CCK-8 法检测细胞活力。结果显示，当 FITC-肝素浓度≤100μg/mL 时，细胞存活率均高于 90%，与未标记肝素组无显著差异（P>0.05），表明低浓度下 FITC-肝素无明显细胞毒性。血液相容性实验中，将 FITC-肝素与新鲜人全血共孵育，观察红细胞形态并检测溶血率，结果显示其溶血率仅为 1.2%，远低于 5% 的安全阈值，且未出现红细胞聚集现象，说明其具备良好的血液相容性。
此外，通过激光共聚焦显微镜可清晰观察到 FITC-肝素在 HUVEC 内的分布，其主要富集于细胞质区域，且随孵育时间延长荧光强度逐渐增强，证明该探针可实现细胞水平的示踪。综上，本研究建立的 FITC-肝素制备工艺高效且温和，所得探针兼具优异的荧光性能与生物相容性，为肝素的体内代谢与靶向递送研究提供了可靠工具。
