CY5.5-COOH：近红外荧光染料羧酸衍生物的精准标记与生物偶联工具
一、分子设计与核心特性
CY5.5-COOH 是基于近红外荧光染料 CY5.5 的羧酸功能化衍生物，通过在 CY5.5 分子中引入羧基（-COOH）基团，实现对含氨基、羟基等生物分子的高效共价偶联。其结构设计融合了菁染料的光学优势与羧酸基团的化学反应活性，是深部组织成像、生物分子标记及纳米材料功能化的核心工具：
（一）CY5.5 荧光骨架
近红外长波长特性：CY5.5 作为 NIR-I 区边缘染料（675-694 nm），激发 / 发射波长为 675/694 nm，组织穿透深度达 1.5-2.5 cm，较传统 NIR-I 染料提升 30%，生物自发荧光干扰降至背景的 1/30 以下。非磺酸化结构赋予适度脂溶性（LogP=4.0），增强膜脂亲和力，适用于细胞膜、脂质体等疏水微环境标记，同时羧基的亲水性改善局部水溶性，支持水性缓冲液中的偶联反应。
光学性能优化：量子产率 0.22（DMF 溶液），消光系数 ε=220,000 M⁻¹cm⁻¹，光稳定性优异（808 nm 激光照射 1 小时后荧光保留 85%），适配 IVIS Spectrum 750 nm 通道、共聚焦显微镜 660 nm 激光及流式细胞仪 APC-A 通道，支持深层组织高对比度成像。
（二）羧基功能基团（-COOH）
亲电反应活性：羧基可在 EDC/NHS 催化下与氨基（-NH₂）形成稳定酰胺键，与羟基（-OH）形成酯键，反应效率＞95%（SDS-PAGE 检测）。羧基 pKa 约 4.5，在中性 pH（7.4）下以去质子化形式（-COO⁻）存在，通过离子键增强与带正电生物分子（如组蛋白）的相互作用，同时可通过活化剂（如 EDC）转化为活性酯，实现对抗体、蛋白、多肽的定向修饰。
连接臂优势：羧基通过 6 原子烷基链与 CY5.5 共轭骨架相连，长度约 1.2 nm，减少空间位阻，确保荧光基团充分暴露，标记后分子荧光量子产率保持率＞95%，且不影响生物分子活性（如抗体亲和力 Kd 变化＜10%）。
二、关键物理化学性质
（一）基础理化参数
（二）反应与光谱特性
偶联条件：与氨基反应的pH 为 6.0-8.5，EDC/NHS 活化时间 30 分钟，形成酰胺键的速率常数 k=1.5×10⁴ M⁻¹s⁻¹（25℃），较传统羧酸染料快 10%。
多色兼容性：与 FITC（FL1）、PE（FL2）、CY7（FL4）联用时串色＜3%，支持 4 色以上荧光成像（如 CY5.5 标记抗体 + Alexa Fluor 488 标记二抗），适用于复杂样本的多参数分析。
三、核心应用领域
（一）生物分子高效共价偶联
利用羧基的活化反应实现精准标记，广泛应用于抗体、蛋白及多肽修饰：
抗体定点标记：通过 EDC/NHS 活化后与抗体的赖氨酸 ε- 氨基偶联，推荐染料 / 蛋白摩尔比 10:1，标记效率＞95%。例如，100 μg 抗 PD-L1 抗体与 20 μM CY5.5-COOH 在 pH 7.5 MES 缓冲液中反应 1 小时，经 PD-10 柱纯化后，流式细胞术显示对肿瘤细胞的结合阳性率＞98%，适用于免疫检查点分子的活体成像。
多肽 / 寡核苷酸修饰：对 N 端氨基修饰的 cRGD 多肽偶联后，HPLC 纯度＞98%，IVIS 成像显示其在肿瘤血管的富集效率比游离多肽高 4 倍（T/M 比达 18:1），适用于肿瘤新生血管靶向示踪及药物递送载体的表面功能化。
（二）纳米材料表面功能化
羧基作为通用连接基团，支持多种材料表面修饰：
氨基化纳米颗粒偶联：与氨基修饰的二氧化硅纳米颗粒（SiO₂-NH₂）在 EDC/NHS 催化下反应，构建的荧光探针适用于 sers 检测（检测限低至 0.1 fM），同时支持光热治疗协同研究（808 nm 激光下局部升温至 45℃）。
脂质体 / 胶束标记：与 PEG - 氨基反应后偶联至脂质体表面，构建的阿霉素递送系统在肿瘤内的蓄积量比未修饰组高 3 倍（4T1 乳腺癌模型），荧光信号可实时监测载体从内吞到核释放的全过程（共聚焦时间序列成像）。
（三）活体深部组织成像与肿瘤诊疗
近红外长波长优势支持深层病灶精准定位：
肿瘤间质成像：在胰腺导管腺癌小鼠模型中，尾静脉注射 CY5.5-COOH 标记的抗纤维连接蛋白抗体，12 小时后肿瘤间质荧光信号 / 正常组织比达 15:1，清晰显示胶原纤维密集区（深度 2 cm），为纤维化肿瘤的药物渗透评估提供可视化依据。
淋巴结微转移检测：皮下注射后 40 分钟，腘窝淋巴结荧光信号达峰值，可识别直径＜500 μm 的转移灶（黑色素瘤模型中检出率比 ICG 提升 4 倍），且信号可持续监测 72 小时，支持淋巴结动态引流分析。
（四）多模态成像与协同诊疗
光谱特性兼容 NIR-I/II 区，支持跨技术平台应用：
荧光 / 光声双模态：结合 CY5.5 的强近红外吸收（800 nm 激发），标记的纳米探针在光声成像中实现 2.5 cm 深度的肿瘤血管三维重建，空间分辨率达 100 μm，为术前放疗靶区勾画提供生物靶区数据。
流式细胞术多色分析：作为 APC-A 通道标记物，与 FITC、PE、CY7 联用时串色＜3%，可同时检测 CD4⁺/CD8⁺/CD25⁺调节性 T 细胞，分选纯度＞98%（BD LSR Fortessa 验证），适用于肿瘤微环境免疫细胞分型。
四、制备技术与工艺优化
（一）高效合成路线
CY5.5 羧基化：通过 Suzuki 偶联反应在 CY5.5 母体引入羧基基团，DMF 作为溶剂，摩尔比 1:1.5（CY5.5 前体：羧酸化试剂），80℃反应 4 小时，HPLC 纯化后纯度≥98%，质谱验证分子量增加 16 Da（羧基取代）。
质量控制：
荧光纯度：UV-Vis 光谱中 675 nm 特征峰与 280 nm 杂峰比值＞15:1，确保无未反应 CY5.5 残留（HPLC 检测残留量＜1%）。
羧基活性：通过 EDC/NHS 活化后与牛血清白蛋白（BSA-NH₂）的反应速率，计算羧基有效活化率＞95%（SDS-PAGE 荧光扫描）。
溶解性验证：10 mg/mL DMF 溶液无浑浊，动态光散射（DLS）测定标记后抗体粒径＜100 nm，PDI＜0.15，保证体内分布均一性。
（二）标记技术优化
位点特异性标记：利用抗体 Fc 段糖基化位点定点引入氨基，实现每个抗体分子精准偶联 1 个 CY5.5-COOH，避免 Fab 段随机标记导致的抗原结合力下降（ELISA 检测 KD 值变化＜8%）。
纳米颗粒表面修饰：通过控制 EDC/NHS 活化时间（5-15 分钟）调节修饰密度（1-5 个 / 颗粒），优化后纳米颗粒的荧光强度与细胞摄取效率呈线性相关（R²=0.98），适用于靶向载体的高通量筛选。
五、实验指南
（二）典型应用操作流程
1. 抗体荧光标记实验
缓冲液准备：将抗体（1 mg/mL）溶于 MES 缓冲液（pH 6.5，含 0.1 M MES、0.15 M NaCl），加入 10 mM EDC 和 20 mM NHS 活化 15 分钟。
偶联反应：加入 15 μM CY5.5-COOH（DMF 溶解，终浓度≤5%），室温避光振荡反应 1 小时。
纯化检测：通过超滤离心（30 kDa 截留）除去游离染料，UV-Vis 计算标记率（A₂₈₀/A₆₇₅＞2.5 为合格），流式细胞术验证细胞结合活性（阳性细胞率＞98%）。
2. 活体肿瘤成像操作
探针配制：临用前将标记抗体溶于生理盐水（浓度 1.5 mg/kg），0.22 μm 滤膜除菌。
动物给药：小鼠尾静脉注射，6-8 小时后置于 IVIS Spectrum 系统，激发滤光片 670/20 nm，发射滤光片 695/20 nm，曝光时间 300 ms，分析肿瘤深部荧光强度（距体表 1 cm 处 T/M 比＞15:1）。
六、挑战与未来方向
（一）现存技术瓶颈
水溶性限制：依赖有机溶剂助溶可能影响蛋白活性（DMSO 浓度＞10% 时抗体结合活性下降 15%），需开发磺酸化 CY5.5-COOH（Sulfo-CY5.5-COOH）提升水溶性至 50 mg/mL in PBS，降低溶剂毒性。
光漂白问题：长时间活体成像中 CY5.5 存在光漂白（每小时衰减 12%），需结合荧光增强技术（如二氧化硅纳米颗粒包载，信号稳定性提升 40%）或开发光稳定型衍生物。
多色成像串扰：与 NIR-II 区染料（如 CY7.5）联用时，需使用窄带滤光片（带宽≤10 nm），建议波长间隔＞50 nm 以避免串色（如 CY5.5 与 CY7.5 间隔 60 nm）。
（二）前沿研究方向
智能响应型探针：引入 pH 敏感腙键连接羧基与 CY5.5，在肿瘤微酸性环境（pH 6.5）释放活性羧基，荧光强度增强 70%，同时触发前药激活（如紫杉醇前药释放效率＞90%），实现 “环境响应 - 成像 - 治疗” 一体化。
多模态诊疗平台：与 MRI 造影剂（如 Gd³⁺）或 PET 示踪剂（如 ¹⁸F）偶联，构建 CY5.5-COOH-Gd 探针，同步实现近红外荧光成像与核素成像，肿瘤定位误差＜100 μm，适用于术前精准分期与疗效评估。
基因编码标记技术：通过 CRISPR 介导的非天然氨基酸插入，在目标蛋白中引入对氨基苯丙氨酸，与 CY5.5-COOH 发生特异性偶联，实现内源性蛋白的活细胞标记（标记效率＞90%），用于实时监测信号通路关键蛋白的动态定位。
CY5.5-COOH 凭借近红外长波长的深部穿透能力、羧基的高效偶联活性及广泛的生物相容性，成为生物医学研究中从分子标记到活体诊疗的关键工具。随着近红外成像技术的普及与标记策略的创新，该试剂正从科研级染料向临床精准诊断的核心材料迈进，为深部肿瘤检测、神经科学研究及靶向药物开发提供高效解决方案。
【星戈瑞stargraydye】以上数据均来自文献/科研资料,星戈瑞暂未进行独立验证, 仅供参考！(以上文中所述仅限于科研实验及实验室环境)
