关于 Sulfo-CY5.5 NHS ester 产品使用的常见问答，仅参考：
原理相关：
Q: Sulfo-CY5.5 NHS ester 是做什么用的？
A:它是一种近红外荧光染料的活化酯形式，主要用于在温和条件下共价标记生物分子（如蛋白质、抗体、肽、寡核苷酸）上的伯氨基（-NH2，主要位于赖氨酸侧链或N末端）。标记后的分子可用于各种基于荧光的应用，如体外/体内成像、流式细胞术、荧光免疫印迹（WB）、免疫组化（IHC）、荧光原位杂交（FISH）、生物分子相互作用研究（如FRET）等。
Q: 为什么选择 Sulfo-CY5.5？
A:Sulfo-CY5.5 相较于普通 CY5.5 具有水溶性磺酸基团：
水溶性更好：减少在水性缓冲液中的聚集和非特异性结合，标记反应相对均一，背景低。
降低疏水性：减少标记后分子（尤其是抗体）的聚集，提高稳定性。
电荷引入：磺酸基带负电，可能影响标记后分子的等电点，需注意。
近红外荧光：激发/发射波长（~678nm/~694nm）位于近红外一区，组织自发荧光弱、穿透深度相对较好，适合活体成像和降低复杂样本背景。
Q: NHS ester 基团的作用是什么？
A:NHS ester 是一种活化基团，它能特异性地与生物分子上的伯氨基（-NH₂）反应，形成稳定的酰胺键，从而将染料分子共价连接到目标分子上。反应会释放 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）。
储存与处理
Q: 如何储存 Sulfo-CY5.5 NHS ester？
A:温度：-20°C，避光干燥储存（最常见是 -20°C）。
环境：干燥、避光、防潮。务必保存在避光密封好的小瓶中，并确保盖子拧紧。水汽是NHS酯最大的敌人，会使其水解失活。
避免反复冻融：建议根据单次使用量分装储存。反复冻融会加速降解。
Q: 使用前如何准备染料？
A:
1. 平衡温度：从冰箱取出后，不要立即打开瓶盖！让整个小瓶在干燥环境中升至室温。这是为了防止冷的瓶壁凝结空气中的水汽，导致染料受潮水解。
2. 短暂离心：轻轻离心小瓶，使粉末或冻干粉沉到底部。
3. 避光：溶解和后续操作全程避光（在黄光或红光下操作，或用铝箔包裹容器）。
标记反应
Q: 标记反应通常在什么条件下进行？
A:
PH：适宜的pH 范围，pH > 9.0 可能增加染料水解和副反应。
温度：室温 (20-25°C)或 4°C。室温反应快，4°C反应温和，可能减少目标分子（尤其是敏感蛋白）的聚集或失活。
时间：根据染料/目标分子比例、目标分子浓度和温度而定。建议通过小试优化。
浓度：通过小试优化，选择适宜的目标分子浓度，以获得良好反应效率并减少副反应。浓度过低可能导致标记效率下降。
纯化与检测
Q: 为什么反应后必须纯化？如何纯化？
A:反应混合物中包含：
1.标记好的目标分子
2.未反应的游离染料
3.水解失活的染料
4.反应副产物（如NHS）
纯化是为了去除未反应染料和水解产物，它们会产生高背景荧光干扰实验结果。
常用方法：
凝胶过滤层析/脱盐柱。是常用、快速有效去除小分子杂质（游离染料、盐、小分子缓冲液成分）。
透析：适用于大体积或对柱子有吸附的情况，但耗时长（可能需要多次换液），且对小分子染料去除效率不如凝胶过滤。
超滤离心管：通过分子量截留去除游离染料。需注意浓度和样品损失。
常见问题与解决
Q: 标记效率低（标记度远低于预期）怎么办？
A:可能原因及对策：
染料失活：检查储存条件（干燥、低温、避光）、溶解操作（快速、无水DMSO）、是否反复冻融。使用新鲜配制的染料。
缓冲液含伯胺：确认缓冲液不含Tris, Glycine, Ammonia等。使用推荐的碳酸盐或磷酸盐缓冲液。
pH过低：检查并调整反应缓冲液pH至8.3-8.5。
目标分子氨基可及性差：尝试稍微提高反应温度或延长反应时间。优化染料比例（适度提高）。
目标分子浓度过低：提高目标分子浓度（2-10 mg/mL）。
计算错误：仔细复核摩尔比计算和试剂用量。
Q: 标记后目标分子发生聚集或沉淀怎么办？
A:可能原因及对策：
标记度过高：降低染料:目标分子摩尔比进行优化。
反应条件剧烈：降低反应温度或缩短反应时间。
缓冲液不合适：确保缓冲液离子强度和pH合适。可尝试加入少量温和去垢剂。
目标分子本身不稳定：优化标记条件（低温、温和比例），加入稳定剂。
Q: 背景荧光高怎么办？
A:可能原因及对策：
游离染料去除不彻底：优化纯化步骤，确保充分去除游离染料（如增加凝胶过滤柱的洗脱体积、重复过柱、延长透析时间/次数）。
标记度过高：降低标记度可以减少疏水相互作用和非特异性吸附。
样本本身自发荧光：尝试使用不同的激发/发射滤光片组合，或使用近红外染料本身就是为了降低此干扰。
Q: 荧光信号弱怎么办？
A:可能原因及对策：
标记度过低：提高染料:目标分子摩尔比进行优化。
染料淬灭：标记物是否过度暴露在光下？确保全程严格避光。检查储存条件（低温、避光）。高浓度时可能存在自淬灭，适当稀释样品。
仪器设置问题：确认仪器（显微镜、流式细胞仪、成像系统）对Sulfo-CY5.5的通道设置正确（激发/发射滤光片、激光器、PMT电压增益）。使用已知阳性的对照样品检查仪器状态。
目标分子失活或丢失：检查标记和纯化过程是否导致目标分子失活或大量损失。进行功能性实验验证（如ELISA验证抗体活性）。
应用体系问题：确认目标分子是否能在应用体系中有效结合（如抗体能否结合抗原）。优化应用实验条件。
注意事项：具体问题需结合实际实验确定，我方为进行具体实验，仅可参考。
