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星戈瑞FITC异硫氰酸荧光素之抗体的荧光素标记方法

时间:2023-03-06    阅读:741    点赞:0

适用于标记蛋白的荧光色素主要有异硫氰酸荧光素(FITC),四乙基罗丹明(RB200)和四甲基异硫氰基罗丹明(TMRITC)。目前应用常见的为异硫氰酸荧光素。


以下stargraydye小编以异硫氰酸荧光素(FITC)为例,简要介绍抗体的荧光素标记方法:

基本原理:

许多蛋白质表面含有较多的赖氨酸残基,这些赖氨酸残基的游离ε-氨基可与FITC共价结合。与FITC结合的抗体可用为特异性的探针,以测定细胞相应抗原的存在。FITC具有很高的量子产量(发射光与吸收光的比值为0.85),且形成的偶联物的稳定性很好,FITC是目前应用最广的荧光染料。

在pH 9.8条件下,赖氨酸残基的游离ε-氨基与FITC发生的亲核反应,由此形成硫脲连接。


标记方法:

异硫氰酸荧光素常用的标记法有以下两种:

1、 搅拌法(适合大样品)

取一定量的纯化后的IgG溶液,用0.5 mol/L pH9.8碳酸盐缓冲液稀释至20 mg/mL。

按荧光素与抗体比1︰20~1︰100(一般用1︰100)称取异硫氰酸荧光素,用pH9.8碳酸盐缓冲液溶解。

将IgG溶液置于电磁搅拌器上,启动开关,轻轻搅拌,以不起沫为准。逐滴加入荧光素液(约10min~15min加完)。实验过程中,随时测定搅拌液的pH值,若低于9.0,则应以碳酸钠溶液调整。置4 ℃搅拌6 h~12 h即可。

2、 透析法(适合小样品)

IgG溶液用0.5 mol/L pH9.8碳酸盐缓冲液稀释成1%浓度,装入透析袋中。

将荧光素配成0.1 mg/mL,其量为1%抗体溶液的10倍,装入烧杯中。

将透析袋置于烧杯中,放电磁搅拌器上4 ℃搅拌24即可。

透析法的优点是标记均匀,非特异性荧光少,但所标记的时间长,荧光素的用量多,约比搅拌法多10倍。

3、 标记抗体的纯化:

标记后溶液是一个混合体,它包括蛋白质与荧光素的结合体,游离的荧光素、游离的蛋白质以及结合过多的蛋白质。对于某些细菌性的诊断荧光抗体,则只需去除游离的荧光素即可。对于一般组织染色荧光抗体,则要去除过度标记的抗体。对于某些特殊要求的组织染色试剂,则必须经过仔细的处理。

1)去除游离的荧光素

透析法:将标记好的抗体放入透析袋中于0.01mol/L pH7.6 PBS中或生理盐水中4℃透析数天,每天多次换液,直至透析液中无游离色素为止。通常约需5~7天才能透析完毕。

凝胶过滤:以G25或G50葡聚糖凝胶装柱进行过滤。该方法速度快,一般1h~2 h即可完成。也可以先透析4h~5h,让去除大部分游离荧光素,再过G25或G50柱。

2)去除过度标记的蛋白质分子

可采用DEAE—纤维素过柱法。利用阶梯洗脱法进行,具体方法如下:

以0.01mol/L pH 7.6 PBS液洗脱。

以0.01 mol/L pH 7.6 PBS液(0.05mol/L NaCl)洗脱。

以0.01 mol/L pH7.6 PBS(0.1mol/L NaCl)洗脱。

以0.01 mol/L PH 7.6 PBS(0.2mol/L NaCl)洗脱。

4、 标记抗体的质量检测

用标准免疫荧光染色试验测定偶联率,或用F/P值对FITC标记质量进行鉴定:

取结合物液0.2ml,加PBS 2.8ml(或两者均改用半量),测定其A490/A280,计算其F/P值。F/P值约高,说明分子上结合的荧光素越多,反之则越少。一般用于固定的标本荧光抗体以F/P=1.5为宜,用于活细胞染色的以F/P=2.4为宜。


注意事项

1、 偶联反应要求在尽可能接近pH9.8的溶液中进行,而且注意在反应过程中要保持此pH水平。

2、 FITC易被光淬灭,因此复合物必须始终避光保存。

3、 如果FITC-复合物对PBS透析不充分,可能会对免疫荧光染色产生干扰。


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