免疫荧光技术是将荧光素如异硫氰酸荧光素(FITC)与相应抗体(或抗原)以化学的方法结合,将荧光标记抗体(或抗原)与标本中相应的抗原结合形成荧光标记的抗体--抗原复合物,用荧光显微镜观察。在镜下见到有荧光存在即推断有抗原抗体复合物的存在,根据已知的抗体(或抗原)即可推知另一个未知抗原(或抗体)的存在。
操作步骤
将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，
透析后抗体液移入小烧杯中
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称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO)使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO
FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFITC／mgIgG；
如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG
在10ml小烧杯中先放入抗体
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按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中
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将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h
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用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G25柱
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收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P比值。第二个荧光素峰为游离荧光素
计算:
2.87×A495
F／P＝────────
A280-0.35×A495
合适的F／P值为2～4。
