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星戈瑞简析荧光素标记抗体的实验步骤

时间:2022-09-14    阅读:605    点赞:0

用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)。在碱条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合,标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光,通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。

 

 

实验材料准备:

1.纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。

2.FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。

3.PBS、DMSO

4.PH9~9.5碳酸盐缓冲液: Na2CO34.3g,NaHCO3 8.6g加蒸馏水至500ml。

5.PD10柱(Sephadex G25柱)

磁力搅拌器,紫外分光光度计等

 

操作步骤

1.将纯化的IgG抗体对PH9~9.5碳酸盐缓冲液透析过夜,透析后抗体液移入小烧杯中

2.称取适量IFTC,加入二甲亚砜(DMSO)(FITC~1mg/1ml DMSO)使终浓度为1mgFITC/1mlDMSO

FITC/IgG比例:如IgG浓度为1mg/ml,FITC/IgG比例约为50μgFITC/mgIgG;

如IgG为5~10mg/ml,则比例为25μgFITC/ml IgG

在10ml小烧杯中先放入抗体

3.按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中

4.将标记物用PBS加至2.5ml,磁力搅拌器室温下避光搅拌2h

5.用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素,先用25ml PBS淋洗G25柱

6.收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰,测定F/P比值。第二个荧光素峰为游离荧光素

 

 

注意事项

1.FITC保存于4℃暗处,使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取,以避免潮解。

2.FITC-DMSO液要临用时配制。

3.碳酸盐缓冲液要新鲜配制。


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