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FITC标记抗体的原理及方法

时间:2022-08-19    阅读:1138    点赞:0

FITC简介

中文名称:异硫氰酸荧光素  

外文名:Fluorescein isothiocyanate isomer I 别称:异硫氰酸荧光橙红,异硫氰酸荧光黄,异硫氰酸荧光红,异硫氰酸荧光素异构体I,5-异硫氰酸荧光素  

化学式:C21H11NO5S 

分子量:389.39  

CAS登录号:27072-45-3 

熔点:>360 °C  

水溶性:易溶于水和酒精溶剂 

外观:黄色或橙黄色结晶粉末  

应用:荧光素(常用于蛋白/抗体的标记),在细胞表面抗原检测及细胞凋亡检测中应用。

 

FITC标记抗体的原理

在碱性条件下(pH8.5以上),FITC的异硫酸基在水溶液中与免疫球蛋白的赖氨酸r氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键,成为标记荧光免疫球蛋白,即荧光抗体。一个Ig分子上能标记15~20个FITC分子。

 

FITC标记抗体的方法

常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体,也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。

 

FITC标记抗体的过程

Marsshall法,其材料和方法及步骤如下:

1、材料:

抗体溶液、0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶(25~50mL)、冰及冰槽(或1000mL烧杯)、电磁搅拌器、灭菌吸管、透吸袋、玻棒、棉线及烧杯(500mL)、pH7.2或pH8.0的0.01mol/L PBS等。
2、操作过程:
a.抗体的准备:取适量已知抗体浓度的溶液,置入三角烧瓶中,加入生理盐水及碳酸盐缓冲液,使最后抗体浓度为20mg/mL,缓冲液容量为总量的1/10,混匀,将三角烧瓶置冰槽中,电磁搅拌(速度适当以不起泡沫为宜)5~10min。
b.荧光素的准备:根据欲标记的蛋白总量,按每毫克蛋白加0.01mg荧光素,用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
c.标记:边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入抗体溶液中,避免将荧光素粘于三角瓶壁或搅拌玻璃棒上(大约5~10min内加完)。加毕后,继续搅拌12~18h。标记期间应保持蛋白溶液于4摄氏度冰箱或冰库中。
d.透析:标记完毕后,将标记的抗体溶液离心(2500rpm)20min,除去其中少量的沉淀物,装入透吸袋中后再置于烧杯中,用pH8.0缓冲盐水透析(0~4摄氏度)过液。
e.过柱:取透析过液的标记物,过Focudex G-25或者Focudex G-50进行系体置换,然后分装、贮存于4摄氏度冰箱或冰库中。

 

FITC标记抗体的保存

以4摄氏度或-20摄氏度低温保存,防止抗体活性降低和蛋白质变性。最好加入浓度为(1:5000)~(1:10000)的硫柳汞或(1:1000)~(1:5000)的叠氮钠防腐,小量分装如0.1~1mL,真空干燥后更易长期保存。

 

FITC标记抗体的应用

1.免疫荧光技术

2.酶联免疫吸附(ELISA)

3.放射免疫测定

4.免疫印迹(western blot)


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